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1、实验六 感受态细胞的制备和重组质粒的转化【实验目的】1.掌握用 CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。2.学习和掌握质粒 DNA 的转化和重组质粒的筛选方法。【实验原理】质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒 DNA 而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源 DNA 的细胞称为转化子。在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的 DN
2、A 操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。细菌吸收外源 DNA 的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell） 。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期） ，才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。用一定浓度的 CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的 DNA分子的能力。对这种现象的一种解释是 CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法”。目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源
3、 DNA 进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/g DNA，甚至1 x 109转化子/g DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。【试剂与器材】一试剂1LB 液体培养基: 参见附录每组配200mL, 其中100mL 分装于500mL 三角瓶中，另各取3mL 装于2只大试管中，其余装于装于500mL 三角瓶中，121高压蒸汽灭菌20分钟。2LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板（1）:配1L LB 液体培养
4、基，加入20g 琼脂粉和1支搅拌棒，同上高压灭菌，趁热取出置搅拌器上冷却，待冷至55左右, 加氨苄青霉素(Ampicillin)至终浓度100g/ml (Amp 储存液一般为100mg/mL), 倒平板，每皿倒约15 mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。使用前半小时在培养基表面加20L 50mg/mL X-gal 和100L 0.1mol/L IPTG，涂匀，待这两种化合物渗入琼脂后，即可用于转化菌的涂布。每组制备 LB 平板2个，LB/Amp 平板5个，LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板6个。3IPTG 储存液(0.1mol/L)：1.2g IPTG 加水至50ml，过滤除菌，4储存。
5、4X-gal 储存液：50mg/ml 溶于二甲基甲酰胺溶剂中，过滤除菌，4储存。51 mol/L CaCl2储存液，使用浓度为0.1mol/L，CaCl2应使用分析纯，配100mL，高压灭菌，全班用。6甘油(灭菌)，全班50mL，同上高压灭菌。7酸洗无菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL 三角瓶分装，同上高压灭菌，烘干备用。二器材1. 37温箱、水浴锅、恒温振荡器等2. 高速冷冻离心机3. 微量移液器等三菌株 大肠杆菌 DH5，基因型为【操作方法】1、感受态细胞的制备（无菌操作）:1）从新鲜培养的 LB 平板上挑单个 DH5 大菌落接种到3 mL LB 培养液中（2） ，37剧烈振荡（210-24
6、0r/min）培养过夜（3） 。2）取1mL 过夜培养物, 接种到含100mL LB 培养液的500 mL 锥瓶中，37剧烈振荡，直至培养液中细菌浓度达到 OD600为0.375-0.4 （4）3）培养物转入2只50mL 离心管中，冰上放置10分钟 ，4,000r/min, 4离心15分钟，弃上清（5） 。4）将菌体悬浮于1020mL 预冷的0.1mol/L CaCl2 溶液中, 冰上放置20分钟(6)。5）4,000rpm, 4,离心10分钟，弃上清，然后将细菌轻轻悬浮在2ml 0.1mol/L CaCl2 溶液中（7） 。若不立即进行转化实验，则进行第6步操作，反之，则进入转化操作。6）缓
7、慢滴入甘油(灭菌)至终浓度为15, 轻柔混匀，将细菌分装成0.5ml/每管，立即液氮冷冻，转入-70冰箱储存，可在2个月内使用（8） 。2、感受态细胞的转化1）设计好实验项目，如正、负对照（参考如下表格，按表格内容操作） ；2）从-80冰箱中取出分装成0.5mL/每管的感受态细胞, 置冰上5分钟或缓慢流水淋至刚好解冻（10） ，立即分装到预冷的1.5mL 离心管中，每管体积参见上表，插入冰上待用；3）对转化管，加入连接产物 DNA 溶液，轻轻混匀；为保险起见，也可先加入一半的连接产物 DNA 溶液，轻轻混匀，剩下的一半置 -20冰箱保存；4）冰上放置30分钟（11） ；5）放入42水浴中，热激
8、40秒（12） ；6）迅速插入冰上，放置5分钟；7）对第1、2项，加入500L LB 培养基，其余加入250L LB 培养基, 37震荡培养1小时（13） ；8）对第1项，各取200L 直接用玻璃珠涂布于2个 LB/ Amp/IPTG/X-Gal 平板上；对第2项，分别取3、30 和100L 细菌培养液，各加无菌水至150L（不超过200L）涂 LB/ Amp/IPTG/X-Gal 平板（此步骤的目的是计算转化率） ；对其余各项，分别各取一半涂布于 LB/ Amp 平板上，余下的转化液置4冰箱保存（14） 。倒置平板，37培养12-14小时。一般来说，含有活性半乳糖苷酶的细菌比无活性酶的细菌生
9、长慢，故过夜培养后可见到毫米大小的阳性白色菌落而阴性的兰色菌落只有针尖大小（15） 。9）挑取白色菌落进行鉴定（见下一个实验） 。【注意事项与提示】（1）倒平板时应避免培养基温度过高，若温度过高，则加入的氨苄青霉素会失效，且培养基凝固后表面及皿盖会形成大量冷凝水，易于造成污染及影响单菌落的形成。若用手掌感受培养基觉得很烫但尚可忍受时，培养基温度即为55左右。制备好的 LB/Amp 平板可于4冰箱储存2个月，时间过长氨苄青霉素将会失效。加了 IPTG/X-Gal 的 LB/Amp平板最好现用。（2）DH5 在平板上过夜生长后，可置冰箱中保存一个月左右；接种新鲜的菌落或菌液有利于细菌细胞的同步快速
10、生长，从而使细菌群体在达到一定的 OD 值后（0.375）大部分细胞都处于感受态。（3）DH5 的生长需要氧气，剧烈振荡的目的是提高培养基的溶氧量以利于细菌的生长（4）达到细菌对数生长早、中期，需时约2.02.5小时，此步骤至为关键，若超过此阶段，则转化效率急剧下降。（5）低温操作的目的是使细胞不再生长，保持其感受态。（6）此步骤的目的是洗涤细胞。（7）此时细胞较脆，悬浮时动作要轻，可用移液枪轻轻吸打。（8）-70冰箱储存的感受态细胞在6-8周后，转化率很快降低。可用一已知标准及浓度的闭环质粒如 pUC18/19鉴定感受态细胞的转化能力。（9）实验中一定要设计正负对照，如用无 DNA 转化物的
11、感受态细菌铺板，若有菌落生长，说明其中抗生素浓度不够或感受态细胞已被污染。加样时速度要快，但要有条不紊，切勿加错！加完样用枪尖稍搅匀。第1项中所加连接产物的量可根据连接反应的终体积而定，一般加一半或2/3，其余置20保存。（10）从-80冰箱中取出冷冻的指管后，也可用双手搓指管，利用掌心的温度解冻。解冻时间勿过长。（11）至少30min，可延长至1h 左右。（12）掌握时间，过长会致死细胞。在许多实验方案中，热激时间设为90至120秒，目前已有实验证明如此长的热激时间是没有必要的，且会引起转化效率的下降 。热激前加入相当于转化液体积1/10的 DMSO 可提高转化效率10倍左右，加入 DMSO
12、 后请勿再剧烈振荡。（13）此步骤使得细菌恢复正常并让 -内酰氨酶基因表达。（14）此步骤可在实验出现错误后进行补救。（15）培养时间勿过长，以免卫星菌落的出现。很多因素都可以影响转化的效率，特别需要注意的有两点，一是制备感受态细胞时的 OD 值，二是所用试剂要分析纯以上，并用双蒸水或超纯水（如 Mili Q）配制。【实验安排】实验前两天挑 E. coli 菌种在 LB 平板上划线，37培养过夜。实验前一天各组要将试剂准备好，包括培养基的消毒灭菌。下午临下课时从平板上挑新鲜的单菌落接种到3mL液体培养基中培养过夜。转化完毕，次日一早观察记录结果，并清理余下的菌种试剂等。【实验报告要求与思考题】
13、1制备感受态细胞和转化时，应特别注意哪些环节。2转化效率的计算：转化效率是指每微克质粒 DNA 转化细胞产生的转化子数目，请列表表示你的转化结果并算出转化率（列出计算公式） 。你所做实验的转化效率（正对照）是多少？ 如果过低（如低于104 cfu/g DNA） ，请分析可能的原因。需要注意的是，连接产物的转化效率是非常低的，为什么？3若实验出现不正常的结果，请分析原因。附录：大肠杆菌的高效转化方法一、试剂TB 溶液：1.512g PIPES，1.1025g CaCl2，9.31875g KCl，溶于水，以5N KOH 调 pH6.7，再加入5.44225g MnCl2，定容至500ml，0.2
14、2m 滤膜过滤灭菌，4保存。SOB 培养基：Tryptone 20g (OXOID 公司)；Yeast extract 5g (OXOID 公司)；NaCl 0.5g，加800ml 双蒸水，加入250mmol/L KCl 溶液10ml，用10mol/L NaOH 调 pH 至7.0，定容至1,000ml，高压灭菌，4保存；使用前加入5ml 经高压灭菌的2mol/L MgCl2溶液。SOC 培养基：含20mmol/L 葡萄糖的 SOB 培养基，SOB 培养基高压灭菌后，降温至60或以下时，加入20ml 经过滤除菌的1mmol/L 葡萄糖溶液，4保存。DMSO二、方法（一）感受态细胞的制备1.将
15、E.coli DH5，涂布于 LB (A-) 培养基上，37过夜。2.挑取2-3个直径2-3mm 的大菌落，接种到50 ml SOB 培养基中。在250 ml 三角瓶中18，200-250rpm 振荡培养，直到 OD=0.6，约需要36-48hr。3.将三角瓶冰浴10分钟。4.转移菌液到50 ml 离心管。2,500g，10min，4。5.菌体用16 ml 冰预冷的 TB 溶液悬浮，冰浴10 min。6.2,500g，10min，4。7.菌体用4ml 冰预冷的 TB 溶液悬浮，加入280ul DMSO。8.菌液于冰浴10分钟后分装到冻存管。每管200ul。液氮冷却，保存于液氮中。大月0分钟后，
16、转移到-40冰箱保存。（二）转化1.将 LB 抗性平板，SOC 培养基，于37预热。2.室温溶解感受态细胞。3.取200uL 菌液加入1.5mL 离心管中，放于冰中。4.加入1-5uL 质粒溶液，用枪头混匀，冰浴30min。5.42热激30秒，冰浴。6.加入800uL SOC 培养基，37，250r/min，1hr。7.涂布 LB 抗性平板，37过夜。1致敏缓冲液中试剂的纯度与浓度对转化率影响很大，试剂必须为分析纯，同时，致敏缓 冲液最好避光贮存于 40。 2制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴低温操作，同时注意无菌操作，防止感受态细胞 受杂菌污染。 342热处理时间很关键，转移速度要快，且温度要准确，同时注意热处理过程中离心管 不要摇动。 4菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机 械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。 5实验用的玻璃器皿、微量吸管及 Eppendorf 管等，应彻底洗净并进
