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1、在 AdvanceBio SEC 聚集体分析之后 进行 Protein A 亲和 IgG 捕获 采用 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案应用简报作者Patrick Cronan、Timothy Rice 和 Michael Kruger 安捷伦科技公司生物治疗药物与生物制药摘要本应用简报介绍了使用 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案对生物治疗样品中聚集体的定量分析。Protein A 亲和捕获在第一维中进行，而体积排阻色谱在第二维中进行。多中心切割用于将样品从第一维转移到第二维。这项技术能够在一次分析中完成整个表征，无需进行馏分收集和
2、多次进样。2软件Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版软件以及 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱软件用于配置系统、设置二维液相色谱方法以及控制二维液相色谱的数据采集（图 2） 。样品样品是购自 Sigma 的 IgG 标准品（部件号 I9640） 。实验部分仪器本研究使用的二维液相色谱解决方案将 Agilent 1260 Infinity 生物惰性液相色谱作为第一维系统。将 1260 Infinity 生物惰性液相色谱系统与安捷伦二维液相色谱 Quick-Change 快速更换阀头、多中心切割阀（带有 12 个出厂已安装的 40 L 样品定量
3、环）和 Agilent 1290 Infinity 高速泵联用，用于第二维色谱。第二维中采用了二极管阵列检测器 (DAD)。图 1 示出了所用的仪器模块。前言蛋白质治疗远远比小分子药物的治疗复杂，因此，阐明这种复杂性成为了一个分析难题。在对这些分子进行开发和使用期间，需要对它们进行深入表征1。 Protein A 是在金黄色葡萄球菌细胞壁中发现的免疫球蛋白-Fc (IgG) 受体。这种蛋白质对多克隆和单克隆 IgG（如人 IgG 1、IgG 2 和 IgG 4 以及来自兔和小鼠等其他物种的 IgG）具有较强的亲和性。固定化的 Protein A 常用于 IgG 的制备和生产级纯化。Agilen
4、t Bio-Monolith Protein A HPLC 分析型色谱柱可用于对复杂混合物或纯样品中的 IgG 进行快速定量分析和小规模纯化2,3。体积排阻色谱 (SEC) 则是生物治疗样品中聚集体定量分析的首选方法。使用 SEC 聚集体分析之后进行 Protein A IgG 捕获，可生成更准确的表征结果，因为所分析的样品更加纯净。采用 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案可使这种分析在一次进样中完成。IgG 的 Protein A 捕获在第一维中进行。然后，在多中心切割定量环中采集洗脱的 IgG，并在第二维中将其洗脱到 Agilent AdvanceBio SE
5、C 体积排阻色谱上，以进行准确的聚集体分析。图 1. 第一维中配有 Agilent Bio-Monolith Protein A 亲和色谱柱和第二维中配有 Agilent AdvanceBio SEC 的二维液相色谱解决方案配置3图 2. 在二维液相色谱系统中配置 Agilent OpenLab CDS ChemStation 二维液相色谱软件，并为第 二梯度和多次切割设置第一参比色谱以及叠加的第一维梯度。该方法设置对话框可以轻松设置 多个次数和定时事件AB4结果与讨论这种二维分离有助于加快单克隆抗体 (mAb) 聚集体的分析速度。在聚集体表征中将两个步骤相结合后，可以在一次进样中执行整个分析
6、，从而省略了馏分收集步骤。图 3 示出了典型的 Protein A 亲和捕获分离结果。用磷酸盐缓冲液捕获样品，并用 500 mM 乙酸（水溶液）进行洗脱。图 4 表明，当 SEC 步骤在二维分析中用作第一维时，可在样品从 Protein A 亲和色谱柱中释放后立即执行该步骤。图 3. 使用 Agilent Bio-Monolith Protein A 亲和色谱柱对 IgG 的 Protein A 亲和捕获分离图 4. 使用 Agilent Bio-Monolith Protein A 亲和色谱柱的 Protein A 亲和捕获 以及使用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱的
7、IgG 体积排阻色谱分离方法第一维分离 使用 UV 检测进行 Protein A 亲和捕获色谱柱Agilent Bio-Monolith Protein A 亲和色谱柱（部件号 5069-3639） ，室温流速0.75 mL/min流动相 A100 mM PBS流动相 B500 mM 乙酸 梯度0 min 时 B 为 0% 0.5 min 时 B 为 0% 0.51 min 时 B 为 100% 2.5 min 时 B 为 100% 2.6 min 时 B 为 0%第二维分离 SEC色谱柱Agilent AdvanceBio SEC 300 , 4.6 150 mm, 2.7 m（部件号 PL
8、1580-3301） ，25 C流速0.35 mL/min流动相10 mM PBS pH 7.4，等度二维液相 色谱模式多中心切割5这一流程证明了通过 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案在一次分析中同时使用 Protein A 和 SEC 技术的可行性。在证明之余，还测试了采用二维方法对不同聚集体浓度的 SEC 检测。在 65 C 下的热水浴中将 IgG 标准品加热处理 24 小时。加热后得到了更大浓度的聚集体，如图 5 和图 6 所示。图 6 表明聚集体与单体和二聚体得到了明显分离。结论Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案为在一个方法
9、中测定 mAb 滴度和聚集体提供了一种通用而高效的方法，无需进行馏分收集和多重进样。Agilent Bio-Monolith Protein A 亲和色谱柱作为二维液相色谱工作流程的第一维，有助于在滴度测定中实现 mAb 的分析级纯化，并可在聚集体分析前作为初始纯化步骤。Agilent AdvanceBio SEC 300 色谱柱对聚集体与单体的分离表现出优异的分离度，可在二维液相色谱工作流程中作为第二维实现准确的评估。图 5. 使用 Agilent Bio-Monolith Protein A 亲和色谱柱的 Protein A 亲和捕获 以及使用 Agilent AdvanceBio SEC
10、 色谱柱的热处理 IgG 体积排阻色谱分离图 6. IgG 和热处理 IgG 的 Agilent AdvanceBio SEC 二维体积排阻色谱分离的 叠加图仅限研究使用。不可用于诊断目的。本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 安捷伦科技（中国）有限公司，2016 2016 年 9 月 1 日，中国出版 5991-7223CHCN参考文献1. Vanhoenacker, G. 等，使用 Agilent 1290 Infinity 二维液相色谱解决方案分析单克隆抗体酶解物，安捷伦科技公司应用简报，出版号 5991-2880CHCN，20132. Lohaus, C. 等，用 Agilent Bio-Monolith Protein A 亲和 HPLC 色谱柱快速测定人多克隆 IgG，安捷伦科技公司应用简报，出版号 5989-9733CHCN，20083. Duong, P. T. 采用 Agilent Bio-Monolith Protein A 亲和色谱柱监测细胞培养液中的单克隆抗体滴度，安捷伦科技公司应用简报，出版号 5991-2990CHCN，2014 查找当地的安捷伦客户中心： 800-820-3278，400-820-3278（手机用户）联系我们： LSCA-China_在线询价：
