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1、硝基酪氨酸在硝基酪氨酸在 2 2 型糖尿病大鼠肾脏的表达及瑞舒伐他汀钙的影响型糖尿病大鼠肾脏的表达及瑞舒伐他汀钙的影响硝基酪氨酸在 2 型糖尿病大鼠肾脏的表达及瑞舒伐他汀钙的影响本文来源：论文 http:/ 目的 观察硝基酪氨酸在 2 型糖尿病模型大鼠肾脏的表达及瑞舒伐他汀钙(rosuvastatin)对其的影响。方法 将大鼠分为正常对照组(c)、糖尿病组(d)、瑞舒伐他汀钙治疗组(n)，比较各组大鼠肾组织中丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(sod)活性和硝基酪氨酸(nt)含量，同时观察血糖、血胰岛素、肾功能和肾脏形态变化。结果 与正常组比较，糖尿病组肾组织中 mda 含量明显上升(p0.
2、05)，sod 活性显著下降(p0.05)，nt 增多(p0.05)，肾功能和肾脏形态受损，而瑞舒伐他汀钙治疗组的上述表达较糖尿病组明显改善。结论 硝基酪氨酸在糖尿病肾病中的表达明显增加，而瑞舒伐他汀钙可以通过抑制氧化应激反应对 2 型糖尿病模型大鼠肾脏产生保护作用。 【关键词】 硝基酪氨酸;瑞舒伐他汀钙;糖尿病肾病;氧化应激abstract objective to evaluate the expression of nitrotyrosine in the kidney type 2 diabetic rats and observe the effect of rosuvastatin
3、 on nitrotyrosine.methods 25 rats were divided into 3 groups of normal rats(c)，diabetic rats(d)，diabetic rats treated with rosuvastatin (n).content of malonaldehyde(mda)，activity of antioxidant enzymes including superoxid edismutase(sod) and nitrotyrosine(nt)in the renal tissue were compared among t
4、he groups.inaddition，blood glucose，serum creatinine(cr)blood ureanitrogen(bun)were mesured;the renal tissue were observed by light micros copy and electron microscopy.results compared with normal group，the level of bun，cr，mda and nt in diabetic rats were significantly increased，but the activity of s
5、od were decreased notably.in addition，the renal pathologic detriment significantly higher than normal controls.but those were improved in the treated group obviously.conclusion oxidative stress take an important role in the development of diabetic nephropathy.the expression of nitrotyrosine in type
6、2 diabetic rats were increased. and antioxidation may be the possible mechanism of the neohroprotective action of rosuvastatin.key words nitrotyrosine;rosuvastatin;diabetic nephropathy;oxidarive stress氧化应激主要是通过自由基对体内的 dna、蛋白质和脂肪的氧化修饰导致组织损伤。越来越多的证据表明，糖尿病引起的氧化应激是导致糖尿病慢性并发症的最根本原因之一 1。深入研究糖尿病中的氧化应激，研究和开
7、发新的抗氧化药物，将为糖尿病慢性并发症的预防和治疗提供新的方向和途径。瑞舒伐他汀钙上市以来，主要作为降胆固醇及抗动脉粥样硬化药。近年来，大量资料及体内外试验表明，其也有很强的抗氧化作用，而硝基酪氨酸(nitrotyrosine，nt)是自由基引起蛋白质损伤产生，可以作为过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite，onoo-)的特异性标志物，目前有关nt 在糖尿病肾脏的表达国内甚少报道。本实验以 2 型糖尿病(dm)模型大鼠为研究对象，探索观察糖尿病大鼠肾组织 nt 的表达，并进一步观察瑞舒伐他汀钙对 nt 表达以及对其他氧化应激标志物的影响。1 材料与仪器1.1 实验动物25 只清洁级 wi
8、star 大鼠，雄性，购自河南大学动物中心，体重 100150g。1.2 试药链尿佐菌素(stz，德国 merck 公司，以 0.1mol/l、ph 为 4.2 的枸橼酸缓冲液溶解，临用前配制);瑞舒伐他汀钙(商品名瑞舒伐他汀钙，阿斯利康制药有限公司);丙二醛(mda)、超氧化物歧化酶(sod)、硝基酪氨酸检测试剂盒(美国 cayman 公司)。1.3 仪器紫外分光光度计 (上海分析仪器厂);自动生化分析仪 (美国technicon 公司);磁酶联免疫测定仪(北京倍爱康生物技术有限责任公司)。2 方法2.1 动物分组与处理大鼠适应性饲养 1 周后，按体重随机分为正常对照组 (c 组，7只)和实
9、验组(b 组，18 只)。c 组给予普通食料，b 组给予高糖、高脂饮食 (由常规饲料加 15%蔗糖、5%猪油、0.5%胆固醇配制而成)。4 周后 b 组腹腔注射 stz(注射量为 35mg/kg),72h 后经尾静脉采血测空腹血糖(fbg)。以禁食后血糖水平空白组均数3 倍标准差为标准，判定 2 型糖尿病大鼠模型是否建立成功。成功者(共 14 只)再随机分为糖尿病组 (d 组，7 只)和糖尿病瑞舒伐他汀钙治疗组(n 组，7 只)，n 组以瑞舒伐他汀钙 500mg/(kg?d)灌胃，c 组、d 组则给予相同剂量的蒸馏水各组大鼠均单笼饲养，自由进食、饮水，给药 8周后代谢笼收集 24h 尿液，低温
10、离心后测尿微量白蛋白。后麻醉大鼠，自下腔静脉取血，摘取双侧肾脏，称重，取部分皮质以 4%的多糖甲醛固定，部分以 3.7%的戊二醛液固定。2.2 检测项目与方法2.2.1 生化指标的检测血糖水平用葡萄糖氧化酶法检测，血胰岛素水平采用磁酶联免疫吸附法检测，血尿素氮 (bun)、血肌酐(cr)由自动生化分析仪检测，24h 尿微量白蛋白采用放射免疫法测定。2.2.2 肾组织匀浆中 mda 含量、sod 活性的测定将 10%的组织匀浆低温离心，取上清液，采用化学比色法测定光吸收度，计算 mda、sod 含量。2.2.3 肾组织免疫学检查常规脱蜡，封闭，一抗 37c 孵育 2h,4c 冰箱过夜，标记二抗，
11、做免疫染色，应用高清晰度彩色免疫图像分析系统(ipp55.0)分析，测定肾小球(平均光密度)直径。2.2.4 肾脏组织电镜观察肾组织固定，脱水，包埋，切片，染色，在 hitachi-7500 透射电镜下观察。2.3 统计学处理实验数据以s 表示，应用 spss13 统计软件进行处理，两组间数据采用 anova 检验，若方差不齐，采用非参数统计检验，p0.05 为差异有显著性。3 结果3.1 各组大鼠血糖、肾功能及病理形态的变化见表 1。表 1 各组大鼠尿白蛋白、血糖、bun、cr 的变化3.2 正常对照组、糖尿病组、糖尿病瑞舒伐他汀钙治疗组病理改变见图 1。 镜下观察发现，d 组大鼠 gbm
12、明显增厚，系膜区增宽，部分肾小球出现硬化，经瑞舒伐他汀钙治疗后，上述病理改变得到改善。3.3 正常对照组、糖尿病组、糖尿病瑞舒伐他汀钙治疗组超微结构改变见图 2。图 2 正常组(c 组)( 7000)、糖尿病组(d 组)( 10000)、糖尿病瑞舒伐他汀钙治疗组(n 组)( 8000)肾脏超微结构由图 2 可见，c 组肾小球基底膜结构清晰完整，血管内皮细胞足细胞未见异常。d组基底膜不均匀增厚，内皮细胞排列紊乱，脱落，完整性破坏，足突增粗融合。肾小管上皮肿胀。部分溶酶体内可见空泡变性，线粒体肿胀。n 组亦可见上述变性，但程度较 d 组减轻。3.4 各组大鼠肾组织中 mda 含量、sod 活性及硝
13、基酪氨酸(nt)的变化见表 2、图 3。表 2 各组大鼠肾组织中 mda 含量、sod 活性及nt 变化造模 8 周后，d 组肾组织中 mda 含量较同期 c 组明显升高，而 sod 活性则较同期 c 组下降。经瑞舒伐他汀钙治疗后，n 组 mda含量较同期 d 组明显下降，s0d 活性则较同期 d 组增加，造模 8 周后，d 组肾组织中硝基酪氨酸(nt)活性较同期 c 组明显升高。经瑞舒伐他汀钙治疗后，n 组肾组织中硝基酪氨酸(nt)活性较同期 d 组明显下降。3.5 各氧化应激指标与尿白蛋白和 cr 的相关分析见表 3。表 3 mda、sod、nt 与 24h 尿微量白蛋白、血 cr 相关分
14、析表 3 表明 mda、nt 与 24h 尿微量白蛋白、血 cr 呈明显的正相关，而 sod 与 24h 尿微量白蛋白、血 cr 呈明显的负相关。 4 讨论dn 是致糖尿病终末期发生肾衰竭的重要原因，其发病机制及治疗方法是目前研究的热点之一。因 2 型糖尿病发病率占 dm 总发病率的 90%，故以 2 型糖尿病模型作为研究对象。在本实验中，成功建立了 2 型 dm 的大鼠模型。该模型发病过程及特征与 2 型糖尿病的临床过程和代谢特征类似。本研究发现，12 周后，糖尿病大鼠各种氧化应激指标包括 mda和 nt 都明显增高，而抗氧化指标 sod 则明显低于正常对照，说明 2型糖尿病大鼠的抗氧化能力
15、明显下降，氧自由基生成增多，促进了糖尿病的发生，这与近年的其他研究一致 2,3 。氧化应激是指体内活性氧类生成和抗氧化防御功能之间平衡的紊乱。机体受到外来的刺激，激活细胞质膜上的还原型辅酶(nadph)氧化复合体发生呼吸链级链反应，释放出大量的 ros。ros 是生物体内有氧代谢过程中产生的活性产物，主要包括氧自由基、过氧化氢、氢氧自由基、单线态分子氧、过氧化酯类等。其具有一定的毒性。dm 时高血糖可激活细胞内蛋白激酶 c(protein kinase c，pkc)信息传导途径，pkc 在巨噬细胞和非巨噬细胞的还原型烟酰胺酰嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)氧化酶的活化过程中起重要作用，而 nad
16、ph 氧化酶被认为是 ros 产生的最重要机制 4。高糖引起的线粒体内膜电位差增大，形成超极化，通过辅酶 q 的电子传递链使氧分子还原，产生大量的 ros5。线粒体电子传递链复合物的抑制剂可有效抑制高糖引起的大鼠肾系膜细胞和肾小管上皮细胞中 ros 的含量也证实了这点 6。本研究还表明糖尿病的氧化应激与糖尿病肾病的发生存在密切关系，2 型糖尿病大鼠成模 12 周后，bun、cr 和 alb 升高，dbm 增厚，系膜区明显增宽，部分肾小球出现硬化，足突成阶段性融合，说明高糖状态下肾脏功能和形态均受到损伤。相关分析表明糖尿病大鼠尿白蛋白排量、cr 与 nt 和 mda 呈正相关，与 sod 呈负相关，说明氧化应激参与了糖尿病肾病的发生发展。chang 等发现局部氧自由基水平与肾小球硬化和系膜增生相关 7，在糖尿病发展中起重要作用。因此，抗氧化治疗可减轻 dm 引起的肾脏损伤。nt 是自由基引起蛋白质损伤的一个重要标志物，目前认为硝基酪氨酸是 onoo-在体内生成的特异性标志物，能敏感反映 onoo-含量8。近年研究发现糖尿病肾病时 n
