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1、药物性耳聋线粒体 12S rRNA 基因 1555G点突变基因检测的实验室技术体系1人头发毛囊组织人头发毛囊组织 DNA 提取方法的研究提取方法的研究技术保障与研发部 魏宏泉摘要摘要 本研究以人头发的毛囊组织为材料，在动物组织总 DNA 提取的经典技术方案基 础上，兼顾效率、成本和产率等三方面因素，对毛囊组织 DNA 提取方法进行了优化，并设计 了实用有效的取样方法。研究结果显示，可以以少至一根带毛囊的头发为材料，在 40 分钟时 间内获得约 0.5g 组织 DNA，其产量和质量可以满足基因检测工作后续流程的需要。同时， 一次提取过程所耗药品试剂的成本约为 0.3 元，大大低于以微量血为材料的
2、试剂盒提取法的成本。在以 RFLP 法对线粒体 12s rRNA 基因 1555 位点进行基因检测的技术体系中，组织DNA 提取是实验室工作的第一步，该工作的效率、质量、成本等因素对整体检测流程具有至关重要的影响。在此之前的研究工作中，我们确定了以微量血为材料提取组织 DNA 的技术方法，但为了使基因检测项目的实施具有更强的可操作性，设计多样化的组织样本采集形式则是必需的。为此，本研究以人头发毛囊组织为材料，旨在建立适用的取样方法和DNA 提取方法的技术体系。1. 材料与方法材料与方法人头发毛囊组织人头发毛囊组织取自健康成年人。取样方法：用镊子夹住头发根部的部位，顺着毛发生长方向用力一拔即可，
3、此时在毛发根部应明显可见白色或半透明的毛囊组织。然后用剪刀剪去大部分的毛干部分，将毛根带有毛囊组织的部分置于 1.5ml Eppendorf 管内。试剂配制试剂配制（1） Proteinase KProteinase K 用去离子水溶解，浓度 20mg/ml。（2） 组织消化液10mM Tris-HCl，pH7.510mM EDTA10mM NaCl0.5 SDS（3） LiCl 溶液无水 LiCl 用去离子水溶解，浓度为 7.5M。（4） TE 溶液10mM Tris-HCl，pH7.50.1mM EDTA，pH8.0参考操作程序参考操作程序（1）加入 60l 消化液，再加入 1l 蛋白酶
4、K 溶液，用涡旋混合器震荡 5 秒钟。药物性耳聋线粒体 12S rRNA 基因 1555G点突变基因检测的实验室技术体系2（2）于 55水浴 2 小时。（3）加入 60l LiCl 溶液，用涡旋混合器震荡 5 秒钟，冰浴 10 分钟。（4）13 000rpm 离心 15 分钟，将上清移入一个新的离心管中。（5）加入 240l 无水乙醇，颠倒混匀后室温放置 10 分钟。（6）13 000rpm 离心 10 分钟，弃上清，用 70乙醇将沉淀洗一次。（7）13 000rpm 离心 5 分钟，弃上清，并将残留乙醇吸干净，室温干燥 20 分钟。（8）加入 20l TE 缓冲液溶解 DNA。（9）用 1琼
5、脂糖凝胶电泳进行检测。头发数量对头发数量对 DNA 提取结果的影响提取结果的影响将拔取的头发分为 6 组，分别为 1、2、3、4、5、6 根头发，按 1.3 中的参考操作程序进行操作，提取 DNA 并用电泳检测结果。蛋白酶蛋白酶 K 消化对消化对 DNA 提取结果的影响提取结果的影响（1） 将拔取的头发分为 4 组，每组 1 根，在操作程序中加入蛋白酶 K 后，55水浴时间分别为 15 分钟、30 分钟、45 分钟、60 分钟，其余步骤按参考操作程序进行。（2） 将拔取的头发分为 6 组，每组 2 根，在操作程序中加入蛋白酶 K 后，55水浴时间分别为 0 分钟、10 分钟、20 分钟、30
6、分钟、60 分钟，其余步骤按参考操作程序进行。（3） 将拔取的头发分为 6 组，每组 2 根，其中 5 组在操作程序中加入的蛋白酶K 浓度分别为 20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml，最后一组不加蛋白酶 K，其余步骤按参考操作程序进行。（4） 将拔取的头发分为 5 组，每组 1 根，在操作程序中不进行加入蛋白酶 K 及水浴步骤，其余步骤按参考操作程序进行。优化操作程序的多样本比较实验优化操作程序的多样本比较实验以五个人为对象，各拔取两根头发作为样本分为两组，每组一根头发，共计10 组，以下列操作程序提取 DNA：（1） 加入 60l 消化液，再加入
7、 1l 蛋白酶 K 溶液，用涡旋混合器震荡 5 秒钟。（2） 于 55水浴 10 分钟。（3） 加入 60l LiCl 溶液，用涡旋混合器震荡 5 秒钟，冰浴 10 分钟。（4） 13 000rpm 离心 10 分钟，将上清移入一个新的离心管中。（5） 加入 240l 无水乙醇，颠倒混匀后室温放置 10 分钟。（6） 13 000rpm 离心 10 分钟，弃上清，用 70乙醇将沉淀洗一次。（7） 13 000rpm 离心 5 分钟，弃上清，并将残留乙醇吸干净，室温干燥 20 分钟。（8） 加入 20l TE 缓冲液溶解 DNA。（9） 用 1琼脂糖凝胶电泳进行检测。（10）各取 2l DNA
8、溶液作为模板进行 PCR，PCR 反应体系及程序设置按照“药物性耳聋易感基因检测的 RFLP 标准操作程序”进行。药物性耳聋线粒体 12S rRNA 基因 1555G点突变基因检测的实验室技术体系32. 结果与分析结果与分析2.1 头发数量对头发数量对 DNA 提取结果的影响提取结果的影响以 1-6 根头发为材料，每组都可以有效提取出基因组 DNA，1-3 根头发组的 DNA 产量有较为明显的随头发数增多而产量也增多的变化，3-6 根头发组的 DNA 产量则没有明显差别。如图 1 所示。在图 1 显示的电泳结果中，第 1、2、3 条带的亮度逐渐增加，说明随着头发数的增加其相应的 DNA 产量也
9、随之增加，而第 3、4、5、6 条带的亮度差异不明显，说明所获得的DNA 产量基本相同注 1。而事实上 1-6 根头发中所含 DNA 的量应该是随头发数量增加而递增的，出现这种矛盾现象的可能原因是：相同的消化液和蛋白酶 K 使用量并不适用于处理不同数量头发。在本实验中，所使用的 60l 消化液和 1l 蛋白酶 K 可能是对应于 1-3 根头发的合适用量，可以达到完全裂解细胞膜和细胞核并释放 DNA 的效果，而 4-6 根头发可能造成了蛋白酶反应底物的过量，这些过量的组织细胞并没有被裂解，因此所释放出的总DNA 量仍与 1-3 根头发释放的 DNA 量相当。从电泳结果显示的条带亮度来看，由于所使
10、用的 DNA 分子量标准每条带的亮度约为20ng，因此可以估测认为，本实验从一根头发中提取出的基因组 DNA 约为 400-600ng，该产量对于基因检测的技术实施来说已经足够，完全可以满足后续工作的需要。2.2 蛋白酶蛋白酶 K 消化对消化对 DNA 提取结果的影响提取结果的影响在蛋白酶 K 反应体系中，组织样本中细胞的裂解率是受酶促反应时间和酶与底物比例影响的。本实验中各组均以一根头发为材料提取 DNA，同时所使用的蛋白酶 K 适度过量，结果 DNA 产量出现了随时间而变化的梯度上升。（1）蛋白酶）蛋白酶 K 消化时间对消化时间对 DNA 提取结果的影响。提取结果的影响。注 1：DNA 条
11、带的亮度差异包含因不同样本的毛囊大小不同而导致的 DNA 产量差异这一因素，本研究中 对此差异忽略不计。本研究中各实验都存在此现象，在此一并说明，后文不再一一注解。Lane1：一根头发提取 DNA 的结果Lane 2：二根头发提取DNA的结果Lane3：三根头发提取 DNA 的结果Lane 4：四根头发提取DNA的结果Lane5：五根头发提取 DNA 的结果Lane 6：六根头发提取DNA的结果Lane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band )1 2 3 4 5 6 M 2000bp图 1 头发数量对 DNA 提取结果的影响Lane1：水浴 15 分钟所提取的
12、DNALane 2：水浴30分钟所提取的DNALane3：水浴45分钟所提取的DNALane 4：水浴60分钟所提取的DNALane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band )1 2 3 4 M 2000bp药物性耳聋线粒体 12S rRNA 基因 1555G点突变基因检测的实验室技术体系4从图 2 可以看出，蛋白酶 K 消化时间与 DNA 产量之间的对应关系是：在 30 分钟之内，细胞裂解率与消化时间成正比，而超过 30 分钟之后，DNA 产量不再增加。产生这一现象的原因可能是：在 60l 消化反应体系中加入 1l 蛋白酶 K 已经达到过量的水平，虽然参考程序中
13、建议消化 2 小时，但本反应体系在反应进行到 30 分钟时已经将组织细胞全部裂解。进一步的计算结果表明，该反应体系中蛋白酶 K 的实际工作浓度为 333ng/l，而哺乳动物组织 DNA 提取的经典技术方案中推荐的蛋白酶 K 工作浓度一般是 100ng/l，本实验中蛋白酶 K 过量 2.3 倍，因此，原本应该会产生的随消化时间（30-60 分钟时间段）而变化的DNA 释放效率因酶的过量而被弥补了。在图 3 中可以看出，在进一步的实验结果中也显示了同样的现象：即 10-30 分钟时，细胞裂解率与消化时间成正比，而超过 30 分钟之后，DNA 产量不再增加。同时我们也可以看到，不进行水浴是无法得到
14、DNA 产物的，这也进一步说明了蛋白酶 K 在消化液成分中的重要性，以及适宜温度对酶促反应的重要性。（2）蛋白酶）蛋白酶 K 用量对用量对 DNA 提取结果的影响提取结果的影响图 2 蛋白酶 K 消化时间对 DNA 提取结果的影响 （1） Lane1-2： 未进行水浴所提取的 DNALane 3-4：水浴10分钟所提取的DNALane5-6：水浴20分钟提取的DNALane 7-8：水浴30分钟提取的DNALane 9-10：水浴60分钟提取的DNALane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band )1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 图 3 蛋白酶 K
15、 消化时间对 DNA 提取结果的影响（2）2000bpLane1-2： 20mg/ml 蛋白酶 K 组Lane 3-4：10mg/ml蛋白酶K组Lane5-6： 5mg/ml蛋白酶K组Lane 7-8： 2.5mg/ml蛋白酶K组Lane 9-10：1.25mg/ml蛋白酶K组Lane 11-12：无蛋白酶K组Lane M： MW marker DL 2000 ( 20ng / band )1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 图 4 蛋白酶 K 用量对 DNA 提取结果的影响（1）2000bpLane1-5：无蛋白酶K的平行实验组 Lane M： MW marker DL
16、 2000 ( 20ng / band )1 2 3 4 5 M 2000bp药物性耳聋线粒体 12S rRNA 基因 1555G点突变基因检测的实验室技术体系5如图 4 所示，当使用的蛋白酶 K 的浓度为 20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml 时，DNA 产量大致相当，其中 5mg/ml 组较其它两组为少。当使用的蛋白酶 K 的浓度为2.5mg/ml、1.25mg/ml 时，DNA 产量较前三组明显减少。无蛋白酶组中只有一个样本有少量 DNA 产物。将使用的蛋白酶 K 用量换算成终浓度，则各组中蛋白酶 K 的工作浓度分别为 333.3ng/l、166.7ng/l、83.3ng/l、41.6ng/l、20.8ng/l，如果以 100ng/l 做为反应体系中蛋白酶 K 的标准工作浓度，可以在发现 2.5mg/ml 组和 1.25mg/ml 组中，蛋白酶 K 用量显然不足，因此 DNA
