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1、新式线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的建立新式线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的建立【摘要摘要】目的：在目的：在ZeaZea LongaLonga线栓法的基础上，对现有的改良线栓法进一步改进，为线栓法的基础上，对现有的改良线栓法进一步改进，为 建立更加稳定的局灶性脑缺血再灌注模型提供参考。方法：建立更加稳定的局灶性脑缺血再灌注模型提供参考。方法：3030 只雄性只雄性SDSD大鼠随机分大鼠随机分ZeaZea LongaLonga线栓法组、改良线栓法组、新式线栓法组三组，每组线栓法组、改良线栓法组、新式线栓法组三组，每组1010 只。比较上述只。比较上述3 3组大鼠局灶性脑缺血再灌注模型
2、的制作时间，组大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的制作时间， 及再灌注及再灌注24h24h后大鼠的神经功能评分、脑梗死体积率及动物死后大鼠的神经功能评分、脑梗死体积率及动物死 亡率等指标，评价经过再改进后的新式线栓法制作的大鼠局灶亡率等指标，评价经过再改进后的新式线栓法制作的大鼠局灶 性脑缺血再灌注模型的有效性。结果：性脑缺血再灌注模型的有效性。结果：ZeaZea LongaLonga线栓法组、改良线栓法组、新式线栓法组大鼠的神经功线栓法组、改良线栓法组、新式线栓法组大鼠的神经功 能评分、脑梗死体积率，模型成功率无明显差异（能评分、脑梗死体积率，模型成功率无明显差异（P0.01P0.01），）， 但新
3、式线栓法组的模型制作时间及大鼠死亡率明显低于但新式线栓法组的模型制作时间及大鼠死亡率明显低于ZeaZea LongaLonga线栓法组和改良线栓法组。结论：经过进一步改进的新线栓法组和改良线栓法组。结论：经过进一步改进的新 式线栓法可以有效缩短模型制作时间，减少动物死亡率，优于式线栓法可以有效缩短模型制作时间，减少动物死亡率，优于 ZeaZea LongaLonga线栓法组、改良线栓法组，使大脑中动脉阻塞再灌注模线栓法组、改良线栓法组，使大脑中动脉阻塞再灌注模 型的建立更加简易稳定。型的建立更加简易稳定。 【关键词关键词】线栓法；局灶性脑缺血再灌注；模型研究线栓法；局灶性脑缺血再灌注；模型研究
4、 【】R-332【】R-332【文献标志码文献标志码】 A【】1007-A【】1007- 85178517（20142014）02-0026-0202-0026-02 缺血性脑血管疾病已成为现代社会致死、致残的最主要疾病之缺血性脑血管疾病已成为现代社会致死、致残的最主要疾病之 一，而抑制再灌注损伤是缺血性脑血管疾病治疗的重要环节，一，而抑制再灌注损伤是缺血性脑血管疾病治疗的重要环节， 开展对脑缺血再灌注损伤模型、损伤机制、防治的研究具有重开展对脑缺血再灌注损伤模型、损伤机制、防治的研究具有重 要意义。其中，最为首要的是建立有效的脑缺血再灌注模型。要意义。其中，最为首要的是建立有效的脑缺血再灌注
5、模型。 而大脑中动脉（而大脑中动脉（MCAMCA）为临床上缺血性脑损伤的易患部位，故）为临床上缺血性脑损伤的易患部位，故 大脑中动脉阻断（大脑中动脉阻断（MCAOMCAO）模型被广泛用于脑梗塞的研究）模型被广泛用于脑梗塞的研究11。 制备制备MCAOMCAO模型的方法有很多种，迄今主要包括光化学法，三氯模型的方法有很多种，迄今主要包括光化学法，三氯 化铁法，线栓法，自体血栓法，电流损伤法，自发性化铁法，线栓法，自体血栓法，电流损伤法，自发性MCAOMCAO等等22 。其中线栓法制备的大鼠局灶性脑缺血模型是目前公认的较。其中线栓法制备的大鼠局灶性脑缺血模型是目前公认的较 为理想的局灶性脑缺血模型
6、为理想的局灶性脑缺血模型. .它具有不开颅，损伤小，重复性它具有不开颅，损伤小，重复性 好的优点，并可准确控制缺血和再灌注的时间，因此应用范围好的优点，并可准确控制缺血和再灌注的时间，因此应用范围 广泛广泛33。但是我们在实验过程中发现，。但是我们在实验过程中发现，LongaLonga线栓法模型因为线栓法模型因为 要分离结扎翼腭动脉，游离颈外动脉，损伤大，动物死亡率高要分离结扎翼腭动脉，游离颈外动脉，损伤大，动物死亡率高 ，模型成功率低。而现阶段的改良模型因为要游离结扎颈外动，模型成功率低。而现阶段的改良模型因为要游离结扎颈外动 脉，手术损伤仍然较大，操作时间偏长，动物死亡率仍然较高脉，手术损
7、伤仍然较大，操作时间偏长，动物死亡率仍然较高 。因此我们对模型进行了进一步的改进，使手术更简洁，操作。因此我们对模型进行了进一步的改进，使手术更简洁，操作 时间更短，动物死亡率更低，模型更具稳定性。时间更短，动物死亡率更低，模型更具稳定性。 1 1材料与方法材料与方法 1.11.1实验动物及分组实验动物及分组3030只只SPFSPF级雄性级雄性SDSD大鼠，体重大鼠，体重250250300g300g， 随机分为随机分为LongaLonga线栓法组、改良线栓法组、新式线栓法组，每线栓法组、改良线栓法组、新式线栓法组，每 组组1010只。由长沙市天勤生物技术有限公司提供，生产许可证：只。由长沙市天
8、勤生物技术有限公司提供，生产许可证： SCXKSCXK（湘）（湘）2009-00122009-0012。 1.21.2试剂及线栓准备试剂及线栓准备TTCTTC染色剂由贵州博奥瑞杰生物科技有限公染色剂由贵州博奥瑞杰生物科技有限公 司提供；栓线由北京沙东生物技术有限公司提供，线身直径司提供；栓线由北京沙东生物技术有限公司提供，线身直径0.0. 26mm26mm，头端包被多聚赖氨酸，线头直径，头端包被多聚赖氨酸，线头直径0.360.02mm0.360.02mm，线长，线长4040 mmmm，和球端相距，和球端相距191920mm20mm处有黑色标记。处有黑色标记。 1.31.3方法方法 1.3.11
9、.3.1术前准备实验前对大鼠适应性喂养一周，自由饮水进食术前准备实验前对大鼠适应性喂养一周，自由饮水进食。术前。术前12h12h禁食，自由饮水。禁食，自由饮水。3 3水合氯醛水合氯醛1ml/100g1ml/100g腹腔注射麻腹腔注射麻 醉大鼠，仰卧位固定，颈前区备皮，常规消毒。醉大鼠，仰卧位固定，颈前区备皮，常规消毒。 1.3.21.3.2模型制备模型制备ZeaZea LongaLonga线栓法组线栓法组44：参照：参照ZeaZea LongaLonga线栓法制备大鼠线栓法制备大鼠MCAOMCAO模型，颈正中线切口，钝性分离，模型，颈正中线切口，钝性分离，暴露右侧胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌之间的三
10、角区域，沿胸锁乳暴露右侧胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌之间的三角区域，沿胸锁乳 突肌内侧分离肌肉筋膜，暴露颈总动脉（突肌内侧分离肌肉筋膜，暴露颈总动脉（CCACCA），颈外动脉（），颈外动脉（E E CACA），颈内动脉（），颈内动脉（ICAICA）。电凝器电凝）。电凝器电凝ECAECA的分支，结扎翼腭动的分支，结扎翼腭动 脉（脉（PPAPPA），并在），并在ECAECA近心端、远心端分别穿线，远心端系紧，近心端、远心端分别穿线，远心端系紧， 近心端系一松结备用，近心端系一松结备用， 用微动脉夹暂时夹闭用微动脉夹暂时夹闭CCACCA与与ECAECA，在，在ECAECA的两线间剪一小口，将的两线间剪一小
11、口，将 栓线经小口插入颈外动脉并送入颈内动脉；改良线栓法组栓线经小口插入颈外动脉并送入颈内动脉；改良线栓法组55 ：颈正中切口，暴露右侧：颈正中切口，暴露右侧CCACCA、ICAICA和和ECAECA，电凝，电凝ECAECA与与ICAICA之间之间 的交通支，结扎并游离的交通支，结扎并游离ECAECA，确保，确保ECAECA残端长度不少于残端长度不少于0.50.5 cmcm。以微动脉夹暂时阻断。以微动脉夹暂时阻断CCACCA及及ICAICA血流，用眼科剪于血流，用眼科剪于ECAECA 残端作一纵行小切口，将线栓从右侧残端作一纵行小切口，将线栓从右侧ECAECA残端插入残端插入ICAICA，轻轻
12、牵，轻轻牵 拉拉ECAECA残端，使其与残端，使其与ICAICA成一条直线，调整线栓角度，使线栓弧成一条直线，调整线栓角度，使线栓弧 度水平向外，与颈前正中线呈度水平向外，与颈前正中线呈4545度水平向外的夹角，移去夹闭度水平向外的夹角，移去夹闭 ICAICA的动脉夹，轻轻将线栓送入颅内，栓塞成功后，结扎的动脉夹，轻轻将线栓送入颅内，栓塞成功后，结扎ECAECA残残 端，移去端，移去CCACCA上的微动脉夹，观察无活动性出血后关闭切口。上的微动脉夹，观察无活动性出血后关闭切口。 新式线栓法组：颈正中线切口新式线栓法组：颈正中线切口3 34cm4cm，钝性分离，暴露右侧胸，钝性分离，暴露右侧胸
13、锁乳突肌和胸骨舌骨肌之间的三角区域，沿胸锁乳突肌内侧分锁乳突肌和胸骨舌骨肌之间的三角区域，沿胸锁乳突肌内侧分 离肌肉筋膜，暴露离肌肉筋膜，暴露CCACCA，在，在CCACCA的近心端和远心端分别穿线，近的近心端和远心端分别穿线，近 心端系紧，距此节心端系紧，距此节1cm1cm处的远心端系一松节备用，在处的远心端系一松节备用，在CCACCA近近ICAICA 分叉处以微动脉夹暂时夹闭，在分叉处以微动脉夹暂时夹闭，在CCACCA的两线间，距的两线间，距CCACCA分叉处分叉处5m5m m m左右，剪一斜行左右，剪一斜行4545小口，松开分叉处微动脉夹进行插线，小口，松开分叉处微动脉夹进行插线， 在栓
14、线标记接近在栓线标记接近CCACCA与与ICAICA分叉处或遇阻力感时停止。分叉处或遇阻力感时停止。 1.3.31.3.3神经功能评分参照神经功能评分参照GarciaGarcia神经功能评分神经功能评分66标准，评价大标准，评价大 鼠的神经行为学，包括以下鼠的神经行为学，包括以下6 6项：自主运动；四肢运动对称性项：自主运动；四肢运动对称性 ；前爪伸展性；攀爬运动；肢体本体感觉；触须反应。采用双；前爪伸展性；攀爬运动；肢体本体感觉；触须反应。采用双 盲法于术后盲法于术后2424小时评分并记录。小时评分并记录。 1.3.4TTC1.3.4TTC染色及脑梗死体积率测定染色及脑梗死体积率测定 于缺血
15、再灌注于缺血再灌注24h24h后麻醉剪下头部，取出脑组织，置于脑模具后麻醉剪下头部，取出脑组织，置于脑模具 中，沿视交叉向后平均切成中，沿视交叉向后平均切成5 5片，将其放入片，将其放入2%TTC2%TTC的磷酸盐缓冲的磷酸盐缓冲 液，于液，于3737温箱中染色温箱中染色30min30min，再用，再用4%4%多聚甲醛固定并摄片。多聚甲醛固定并摄片。 1.3.51.3.5观测指标记录从切口至插入栓线模型制作的时间；分析观测指标记录从切口至插入栓线模型制作的时间；分析 动物死亡原因，统计死亡率；于造模动物死亡原因，统计死亡率；于造模24h24h后对存活大鼠进行神后对存活大鼠进行神 经功能评分，统
16、计模型成功率；用经功能评分，统计模型成功率；用Image-Pro-Image-Pro- PlusPlus软件测量软件测量TTCTTC染色后脑梗死体积率。染色后脑梗死体积率。 1.3.61.3.6模型成功标准神经功能评分为模型成功标准神经功能评分为4 41212 分，存活超过分，存活超过24h24h，取大脑无蛛网膜下腔出血，大脑冠状切面，取大脑无蛛网膜下腔出血，大脑冠状切面T T TCTC染色可见明显苍白梗死区者为造模成功。染色可见明显苍白梗死区者为造模成功。 1.3.71.3.7统计学分析各组计量资料均采用统计学分析各组计量资料均采用SPSS19.0SPSS19.0统计学软件进统计学软件进 行处理，数据以行处理，数据以“均数均数标准差标准差”（xsxs）表示，数据呈正态）表示，数据呈正态 分布时进行单因素方差分析，不呈正态分布采用非参数检验。分布时进行单因素方差分析，不呈正态分布采用非参
