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1、细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤1. 爬片的准备1)爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；用盖玻片时，可根据自己的需要用小砂轮或玻璃刀剪裁成合适的大小，以备置于 6 孔板、12 孔板或 24 孔板；2)将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡过夜，第二天先用自来水冲洗 20 遍，然后置于无水酒清中浸泡 6 小时，再用三蒸水冲洗 3 遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后高压消毒。高压消毒后取出放入烘箱中烘干，烘干后可放入超净台中备用。3)可将爬片用多聚赖氨酸处理，以使细胞与爬片结合更牢固。1mg/ml 的多聚赖氨酸用 0.22um 的滤器过滤除菌后分装于经过无菌处理的 1ml 细胞冻存管内保存在 4里，
2、三个月内仍然可以使用。用时将高压灭菌过的爬片放到0.1mg/ml 的多聚赖氨酸溶液内浸泡 5min，无菌晾干即可（放入培养板孔内注意爬片的正反面） 。或将爬片铺于培养皿中，将多聚赖氨酸溶液滴于爬片上，室温 10 分钟后，吸除玻片上的溶液，在超静台内晾干后使用。储存、稀释和吸取多聚赖氨酸要使用塑料制品。2. 细胞爬片1)胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中，充分吹打，使之成单细胞悬液， 计数。 2)根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内。滴加细胞悬液时，根 据爬片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，然后将爬 片置于液滴上，压紧，使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，防止 加
3、细胞悬液时爬片漂起，造成双层细胞贴片。若细胞贴壁能力不强，爬片 可经多聚赖氨酸浸片后放入。 3.细胞的固定及免疫荧光1)在培养板中培养好细胞后，吸除培养基，一般先使用 PBS 轻洗细胞 23 min，然后再做固定（凋亡的 TUNEL 染色等可以不清洗） 。2)固定：加入 4%多聚甲醛(PBS 配制)固定 20 分钟。如果暂时不能立即做组化检测，使用含 0.4%多聚甲醛的 PBS PH7.4 浸泡细胞（注意在免疫组化检测完成前不要让细胞变干，否则细胞收缩形态不好） 。3)除去多聚甲醛，使用 PBS 轻洗细胞 33 min。4)通透：0.5%Triton X-100(PBS 配制)室温通透 20m
4、in（细胞膜上表达的抗原细胞膜上表达的抗原省略此步骤省略此步骤） 。5)除去 Triton X-100，使用 PBS 轻洗细胞 33 min。6)内源性过氧化物酶处理：3% H2O2 孵育 15 min（选作，二抗连选作，二抗连 HRP 必需必需做做，其他的如做免疫荧光染色不用做） 。7)除去 H2O2，使用 PBS 轻洗细胞 33 min。8)封闭：用 10%的与二抗同源的血清(PBS 配制)封闭半小时。封闭结束后千万封闭结束后千万不要洗，直接上一抗不要洗，直接上一抗。 9)一抗：滴加足够量适宜浓度的一抗，4孵育过夜（或 37，60 min） ；若有两种一抗（要是不同种属的）则同时孵育，两种
5、二抗亦同时孵育（二抗同时使用时最好是同一种属） 。10) 除去一抗，使用 PBS 轻洗细胞 33 min。11) 二抗：滴加足够量适宜浓度的二抗，37，30 min（从加荧光二抗起，后面从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行所有操作步骤都尽量在较暗处进行） 。12) 除去二抗，使用 PBS 轻洗细胞 33 min。13) 二氨基联苯胺（DAB）底物显色：室温下避光孵育 5 至 10 分钟，或直至样本出现棕褐色（选作，二抗连得是酶的必做选作，二抗连得是酶的必做，显色时间严格控制，要避免显色过度引起假阳性；二抗连的是荧光素的不用做） 。14) 除去显色工作液，使用 PBS 冲洗细胞 34 次。15) 复染核： 0.5ug/ml DAPI（或 200nM Hoechst 33342）避光孵育 5min。 16) 使用 PBS 轻洗细胞 45min，洗去多余的 DAPI。17) 取爬片时由于爬片与培养皿底结合较紧，张力较大，可将注射器针头针尖向背面做个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出即可。18) 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。19) 保存细胞爬片的时候，先在培养皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便实验时取片。并在盖子上做标记，一般-20可保存 2-3 个月。
