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2、研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生繇嘭导师签章：枷嵫年月日目录愀剃二Y 2 3 9 7 8 3 8中文摘要1英文摘要5研究论文F A K 在C C l 4 诱导大鼠肝纤维化和自发逆转肝组织中的动态表达及其与在体肝星状细胞增殖的关系前言9日! J 舌材料与方法1 1结果2 6附图3 0讨论4 0结论4 3参考文献4 4综述肝纤维化发生机制研究新进展“4 6致谢5 4个人简历5 5中文摘要F A K 在C C l 4 诱导大鼠肝纤维化和自发逆转肝组织中的 动态表达及其与在体肝星状细胞
3、增殖的关系摘要肝纤维化( h e p a t i cf i b r o s i s ，H F ) 是肝脏对各种慢性损伤产生的一种修复反应，其主要病理特征是细胞外间质( e x t r a c e U u l a rm a t r i x ，E C M ) 在肝组织 内的过度合成和异常沉积。当肝脏受到慢性损伤时，纤维组织生成，损伤因素若不及时去除，纤维组织则持续性增生，最终形成肝硬化。肝纤维化是肝硬化发展的必经途径，肝纤维化是可逆的，而肝硬化则难以逆转。因此，研究肝纤维化的发病机制，从而阻断甚至逆转肝纤维化至关重要。肝星状细胞( h e p a t i cs t e l l a t ec e l
4、 l s ，H S C s ) 又称I t o 细胞、储脂细胞、窦状隙周围细胞，位于窦周D i s s e 间隙和肝细胞间窝内。正常情况下，H S C s处于静止状态，而当炎症、损伤等因素刺激时，H S C s 被激活，产生大量以胶原为主的E C M 成分和各种细胞因子。H S C s 是肝脏纤维组织生成的主要细胞，其活化、增殖和迁移可以启动整个肝纤维化过程，是肝纤维化发生、发展的中心环节。0 【一平滑肌肌动蛋白( a l p h a - s m o o t hm u s c l ea c t i n ，仅S M A ) 是H S C s 一个激活标志物，正常肝脏中除了血管壁平滑肌细胞有少量表
5、达外，其他肝脏细胞均无仅S M A 表达。H S C s 活化后难以恢复静止状态，肝脏主要通过细胞凋亡机制来去除活化H S C s ，而这恰是肝纤维化发生逆转的关键所在。因此，如何抑制H S C s 活化和增殖成为逆转肝纤维化的重要策略。黏着斑激酶( f o c a la d h e s i o nk i n a s e ，F A K ) 是一种非受体胞质酪氨酸激酶，处于整合素和生长因子等多种信号传导通路的交汇点，其缺失或表达异常与多种肿瘤的发生发展密切相关。近年来，对F A K 的研究已从肿瘤领域逐渐延伸至纤维化领域。在前期研究中，我们发现在胆总管结j ：L ( b i l ed u c t
6、l i g a t i o n ，B D L ) 大鼠肝纤维化模型中，F A K 与在体大鼠H S C s 活化和增殖呈正相关。而F A K 在肝纤维化逆转中的表达改变尚未见报道。目的：旨在阐明F A K 在肝纤维化发展以及自发逆转过程中的动态表达，并探讨其动态表达与H S C s 活化、增殖的关系，从而为寻求有效预防和逆转肝纤维化的新方法提供实验依据及理论基础。中文摘要方法：7 2 只健康成年雄性W i s t a r 大鼠，随机分为模型组( 2 4 只) 、逆转组( 2 4 只) 和对照组( 2 4 只) ，采用四肢轮流皮下注射4 0 C C l 4 橄榄油溶液( 2m 卜埏，每周2 次)
7、 共5 周，建立大鼠肝纤维化模型，成功建立动物模型后，停止应用C C l 4 并正常饲养5 周，建立肝纤维化的白发逆转模型，正常大鼠作为对照组，造模过程中无大鼠死亡。H a e m a t o x y l i na n de o s i ns t a i n i n g ( H E 染色) 、M a s s o n St r i c h r o m es t a i n i n g ( M T 染色)和天狼猩红染色方法观察肝脏病理学改变。免疫荧光方法检测大鼠肝组织中F A K 及0 【S M A 的表达。采用免疫荧光双标记法利用激光扫描共聚焦显微镜测定在体活化H S C s 中F A K 及I
8、 X S M A 的共表达改变。( 亘) W e s t e mb l o t 和r e a l t i m ef l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i o nP C R ( r e a l t i m eP C 鼬检测F A K 蛋白及F A K m R N A 在大鼠肝组织中的表达。结果：H & E 、M T 染色和天狼星红染色结果显示：C C h 诱导的大鼠肝纤维化模型和自发逆转模型成功建立后，随着C C l 4 给药时间的延长，肝细胞变性坏死逐渐增多，且大鼠肝纤维化程度逐渐加重；在停止注射后，随着自发逆转时间延长，己形成的纤维组织逐渐减少，肝细胞
9、逐渐恢复正常形态，再生肝细胞增多。i x S M A 免疫荧光染色显示：对照组正常大鼠肝组织中，a 。S M A 仅在血管壁平滑肌细胞有弱阳性表达，随着造模时间延长，c 【S M A 主要分布于纤维间隔、汇管区及增生的胆管周围细胞，造模1w k 、3w k 和5w k 时大鼠肝组织内仅S M A 累积阳性光密度值均显著高于正常对照组( 1 0 1 士0 0 2w0 6 9 士0 2 ，1 2 4 + 0 0 3w0 6 9 + 0 0 2 ，1 5 5 + 0 0 3w0 6 9 土0 0 2 ，P 毫誉-研究论文AC 0 a t r e l1 w k3 w k5 w kR e1 w kR e
10、3 w kR e 5 w k囵“_ _ _ _ _ _ 一- _ _ 。_ 一l 一一一一一O 6o 5o 4o 3o 2o 1F A K1 2 5 k DG A P D H3 7 k DC o n t r o l1w k3w k5w kl e1w kl e3w kR e5w k G r o u p sF i g 7T h ec h a n g e so fF A Kp r o t e i ni nr a tf i b r o t i ch e p a t i ct i s s u e sb y W e s t e r nb l o t A ：T h ee x p r e s s i o no
11、 fF A Kp r o t e i ni nr a tf i b r o t i ch e p a t i ct i s s u e s B ：T h er e l a t i v eo p t i c a ld e n s i t yv a l u e so fF A Kp r o t e i ni nr a tf i b r o t i ch e p a t i ct i s s u e s W e s t e r nb l o ta n a l y s i sw a su s e dt od e t e c t e dt h ee x p r e s s i o nc h a n g
12、eo fF A K ，a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e l a t i v eo p t i c a ld e n s i t yo fF A K G A P D Hi nr a th e p a t i ct i s s u e sw e r ei n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yf r o m1w kt o5w ki nm o d e lg r o u pt h a nt h a to fc o n t r o lg r o u p ，尸 O 0 1 ；a tR e1w k ，
13、R e3w ka n dR e5w k ，t h er e l a t i v eo p t i c a ld e n s i t yo fF A K G A P D Hw e r el o w e rt h a nt h a ta t5 w ki nm o d e lg r o u p ，a n di tw a sd e c r e a s e dg r a d u a l l y , a n dd i f f e r e n c e sw e r ef o u n db e t w e e nt h e m F A Kp r o t e i nw a se n h a n c e dd u
14、 r i n gt h ep r o g r e s s i v el i v e rf i b r o s i sa n dw a sd e c l i n e dd u r i n gi t sr e v e r s a l 目la一2a)IiI。器ji壹胃j-口一g翟a。AIIB一蛊研究论文1 41 2l O86420c o n t r o l1W k3W k5W kR e1W kR e3W kR e5W kG r o u p sF i g 8T h ec h a n g e so fF A Km R N Ai nr a tf i b r o t i ch e p a t i ct i
15、s s u e sb yR e a lt i m eQ - P C RR e a l t i m ef l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i o nP C Ra s s a yw a su s e dt od e t e c t et h ee x p r e s s i o nc h a n g eo fF A Km R N A ，a n dt h e2 c a c c o u n t e df o rt h er e s u l t s T h ev a l u eo f1w a sa s s i g n e dt on o r m a l i z e de x p r e s s i o no fF A Km R
