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1、2009.4(总第155期）山东食品发酵-3-Shandong Food Fermentation专题综述许多微生物，尤其是细菌，当它们在疏水培养基中生长时会产生生物表面活性剂。生物表面活性剂与人工表面活性剂相比更有效，稳定，有选择性，对环境友好1。1968年Armia等2首次发现在枯草芽孢杆菌株（Bacillus subtilis）发酵液中分离得到了一种脂肽类表面活性剂，呈晶状，商品名为表面活性素（surfactin）。这种生物活性物质可以显著地降低表面张力，可以在20mol/L的浓度下将水的表面张力从72mN/m降低到27mN/m，是迄今报道的效果最好的生物表面活性剂之一。生物表面活性剂可
2、分为6大类3：糖脂类、脂肽/脂蛋白类、磷脂类、脂多糖蛋白复合物、脂肪酸和中性脂等。脂肽类生物表面活性剂一般是革兰氏阳性的芽孢杆菌的代谢物。脂肽分子由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成4，脂肽分子中多个氨基酸组成的肽链形成亲水基，脂肪烃链形成亲油基。由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，脂肽类生物表面活性剂在医药、食品、化妆品及微生物采油等领域有重要的应用前景，已成为研究开发的热点5。1 脂肽类表面活性剂的生产菌株自然界中多种微生物能产生表面活性物质，如酵母菌、真菌、细菌都可产生。其中最主要是假单胞菌（Pseudomonas sp）、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、节杆菌（Arthrob
3、acter sp.）、 分枝杆菌（Mycobacterium sp.）和丁酸梭菌脂肽类生物表面活性剂产生及鉴定刘 飞1 田延军3 胡孝丛2 赵祥颖3 刘建军1.2.3 杨丽萍3（1 山东农业大学食品科学与工程学院 泰安 271018）（2 山东轻工业学院食品与生物工程学院 济南 250353）（3 山东省食品发酵工程重点实验室 济南 250013）摘 要 脂肽是由微生物代谢产生的一类具有很强表面活性的生物表面活性剂，本文主要介绍了产脂肽类生物表面活性剂菌株及筛选方法，概述了脂肽类生物表面活性剂的定性检测方法。 关键词 微生物 脂肽 鉴别 定性Production and Identificat
4、ion of Lipopeptide BiosurfactantLiu Fei1 Tian Yan-jun3 Hu Xiao-cong2 Zhao Xiang-ying3 Liu Jiang-jun1， 2， 3 Yang Liping3（College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Tai an， 271018）（School of Food and Bioengineering， Shandong Institute of Light Industry， Ji nan， 250353 ）
5、（Food & Fermentation Engineering Key Lab of Shandong Province， Ji nan， 250013 ） Abstract：The lipopeptide is typically synthesized by microorganisms which is an important kind of biosurfactants，This article mainly introduces lipopeptide producing strains and screening methods and reviews the detectio
6、n methods of the lipopeptide. Key words：Microorganism；Lipopeptide；discrimination；characterization山东食品发酵2009.4(总第155期）-4-Shandong Food Fermentation专题综述（Clostridium tyrobutyricum ）等，但研究最多的 是假单胞菌和革兰氏阳性芽孢杆菌。不同的细菌能产生不同种类的表面活性剂，假单胞菌主要产生糖脂类生物表面活性剂，如鼠李糖脂；革兰氏阳性芽孢杆菌主要产生脂肽类生物表面活性剂，代表性的有Surfactin和Iturin6。根据Ron
7、and Rosenberg7，生物表面活性剂有各种生理作用，可为其产生菌株提供以下益处： 通过乳化作用增加水不溶性基质的表面积增加疏水物质的生物利用率结合重金属参与发病机制具有抗菌活性调整微生物附着表面或从表面分离根据这些生理作用，生物表面活性剂产生菌能在各种环境中发现。许多产生菌从被疏水有机化合物污染的土壤或水样中被分离，例如炼油厂的废油。有一种生物表面活性剂产生菌，树脂枝孢霉也被称作“煤油真菌”，是从飞机的油箱中分离的8。相反，未被污染的环境也已经筛出有研究意义的菌株，例如自然的土壤。报道有称海洋环境也是可行的取样地点。然而，Bodour and Miller-Maie研究表明污染的土壤比
8、未污染土壤的产量更高9。2 脂肽分类、结构及其分析2.1 脂肽分类脂肽主要有表面活性素类（surfactin），伊枯草素类（iturin），芬芥素（fengicin），大侧柏素（plipastatin），地衣素（lichenysin），帕米拉素（pumilacidin），多粘菌素（polymixin）等10。刘向阳等按脂肽结构特征将其分为环状脂肽（cyclic lipopeptide）和线形脂肽（linear lipopeptide）两大类11。2.2 脂肽结构脂肽类生物表面活性剂结构上含亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分。其中肽链上的氨基酸能以内酯或酰胺键形式与脂肪烃链的羧基、羟基或氨基结合形
9、成环状结构。因此，脂肽类生物表面活性剂一般是以内酯或酰胺键结合而成的环状脂肽（cyclicli popeptide）6。环状脂肽主要包括脂肪酸成环的环状脂肽、脂肪酸接环的环状脂肽及脂肪酸离环的环状脂肽。线形脂肽是指氨基酸依次连接成线状、首尾不相连且无环状结构的一类脂肽，脂肪酸与肽链N-端的-氨基或其他羟基相连。有直链结构和支链结构之分。目前报道的仅有螺旋形素（spiroidesin）及TAN 1511系列11。脂肽分子中脂肪链部分的碳原子数一般在1219之间，肽链部分的氨基酸残基数在613之 间。由于肽链中氨基酸的个数、种类及连接顺序的不同，以及脂肪链中碳原子个数及支链的位置不同，也会导致形成
10、更多的脂肽同系物12。如枯草芽孢杆菌产生脂肽类生物表面活性剂Surfactin和伊枯草菌素Iturin，前者是-羟基脂肪酸和肽以内酯键结合，后者是-胺基脂肪酸和肽以酰胺键结合13。研究发现，Surfactin的结构类似物差别在于氨基酸的种类、联接顺序、碳链的碳原子个数及支链位置不同。2.3 结构分析脂肽类生物表面活性剂的结构分析方法通常采用提取后用硅胶色谱、HPLC等方法对脂肽组分进行组分纯化，对纯化的均一性的脂肽生物表面活性剂组分，先用红外光谱（FT-IR）和液质联用仪（LC/MS）对脂肽结构进行初步分析，测定其分子量等，获得有用的关于结构的信息。然后用盐酸水解脂肽，得到混合氨基酸和混合脂肪
11、酸，分子中氨基酸的组成用氨基酸自动分析仪和纸层析等方法检测。脂肪酸的结构测定时先进行甲酯化，再用色质联用仪（GC/MS）或核磁共振仪（1H-NMR）进行研究。李蔚14等用地衣芽孢杆菌株（Bacillus licheni-formis）产生的一种脂肽类表面活性剂，该产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳、红外光谱（IR）、色谱-质谱联用（GC-MS）和纸层析（PC）分析表明：其疏水基半分子为-甲基 十四碳脂肪酸及-羟基十八碳脂肪酸；亲水基半分子含天门冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、异亮氨酸（Lle）、缬氨酸（Val）、赖氨酸（Lys）等氨基酸，为一种由脂肪酸和肽组成的2009.4(总第155期）山东食品发
12、酵-5-Shandong Food Fermentation专题综述脂肽类生物表面活性剂。3 菌株筛选及产物定性生物表面活性剂的生产首先依赖于生产菌。一个有效的筛选方法是成功分离新的和有研究意义的产生菌或其变种的关键。3.1 菌株的筛选与分离在自然环境中，用含疏水基的富集培养基来分离产表面活性剂的微生物，原则是为产生菌提供有利的生长条件，而不利于其竞争菌的生长。另外还有疏水层析和复制平板技术能在疏水性培养基中生长是一种指示生物表面活性剂产生的间接筛选方法，但是这些特征并不总是与之相关，并且筛选培养基的条件或多或少地影响表面活性剂的产生。因此，有可能样品中存在的产生菌在所用的富集培养条件下不能被
13、富集。Mercade等15用废弃的润滑油作为唯一的碳源，从石油污染的土样中分离出产生物表面活性剂的菌株。他们分离了44株能够在烃类中生长的菌株。其中，5株能产生生物表面活性剂。Schulz and colleagues16在筛选能降解正烷烃的产表面活性剂微生物的过程中，分离了来源于海洋的3株细菌。作为富集培养基，他们用含C14和C15正烷烃的无机培养基，还用带有被烷烃浸透滤纸盖子的琼脂平板。Rahman等人17通过富集技术从被烃类污染的环境中分离了130株降解石油的菌种。应用了含有原油作为唯一碳源的矿物盐培养基。发现其中的两株产生生物表面活性剂。对烃类的降解和消耗可以通过Hanson等人制定的
14、比色法来观察18。通过向含烃类的液体培养基添加一种有色氧化还原指示剂，2，6-二氯靛酚（DCPIP），很容易得到比色分析的结果。DCPIP能被降解烃类的细菌吸收。通过电子吸收和转换从蓝色变为无色。因此，培养基脱色作用显示出烃类的降解。但是氧化还原指示剂DCPIP可能对一些有机体有毒。3.2 生物表面活性剂产生菌株鉴定生物表面活性剂的产生菌株的大部分的筛选方法基于表面活性剂的物理效应。也可从菌株干预疏水界面的能力来进行探讨。对于首次筛选分离，定性方法一般来说是足够的。评价生物表面活性剂的表面活性可以用空气/水之间的表面张力和油/水界面的界面张力来表示；或者用乳化液的不稳定性（破乳能力）和亲水亲油
15、值（HLB）来表示；或者用生物表面活性剂的效率 临界胶束浓度（CMC）来表示19。测定发酵 上清液的界面或表面活力是最直接的筛选方法，适用于产生物表面活性剂微生物初步筛选。液体界面或表面活力可用多种方法测定。3.2.1 CTAB琼脂培养基此方法是一种用于胞外糖脂和阴离子表面活性剂的半定量检测，是Siegmund and Wagner发展的。20淡蓝色矿物盐琼脂平板含有阳离子表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵和碱性染料亚甲基蓝。如果平板中的微生物产生阴离子表面活性剂，菌落周围形成深蓝色圈，如图121。3.2.2 血平板法羊血红细胞的溶解是一种简单容易的衡量表面活性剂活性的方法22。是否具有溶血圈来判
16、断该菌种是否可以产生生物表面活性剂，溶血圈的大小代表了菌种产生表面活性剂的能力。因为产生生物表面活性剂的菌种有很强的抗菌溶菌作用，它可以将血琼脂平板上的血细胞水解，使菌落的周围产生明显的透明环，如图121，23。图1 左侧：生长在CTAB琼脂培养基的假单胞菌，4个菌落周围的蓝色圈指示生物表面活性剂的产生。右侧：在血平板上生长的铜绿假单胞菌，菌落周围的溶血圈指示生物表面活性剂的产生。3.2.3 油扩散法油扩散法，也称作生物表面活性剂排油活性测定24，是由Morikawa et等发展起来的25。在此分析中，10L原油加入装有40mL蒸馏水的山东食品发酵2009.4(总第155期）-6-Shandong Food Fermentation专题综述培养皿中，表面形成一层很薄的油膜。然后，将10L培养液或培养上清液轻轻地加到油层中心。如果生物表面活性剂存在于上清液，
