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1、表达人自身抗原表达人自身抗原 SSBLaSSBLa 重组体的构建及其鉴定重组体的构建及其鉴定表达人自身抗原 SSB/La 重组体的构建及其鉴定2010-11-11 邓安梅 仲人前 孔宪涛 系统性自身免疫病的特征之一是循环中出现一些抗核蛋白的自身抗体。多数自身抗体，除抗 DNA 抗体外，在自身免疫病的病理机制中并无直接作用。然而，特异性自身抗体与相应的自身免疫病病情高度相关。探讨自身免疫病中的抗原抗体作用有助于我们了解自身免疫病的发病机制，为疾病的早期诊断及治疗打下基础。自身抗原 SSB/La 可被干燥综合征(SS)、系统性 红斑狼疮(SLE)等自身免疫病患者的血清识别1 ，但其抗原表位的精确定
2、位、表位 与疾病相关性的分析等方面尚存在分歧2，3 。本课题旨在构建表达人自身抗原 SSB/La 的重组体，进一步在大肠杆菌中表达重组抗原，为深入研究疾病的发病机制奠 定基础。 1 材料及方法 1.1 质粒、菌株、酶及所用试剂：PGEX-2T 质粒；JM 109 菌株；AMV 逆转录酶；Taq DNA 多 聚酶、EcoR内切酶、BamH内切酶、T4DNA 连接酶(Pharmacia)；QIAprep Spin Plasmid M iniprep Kit DNA Purification。 1.2 用逆转录PCR 方法克隆 SSB/La 的 cDNA：检索 EMBL 库，根据引物设计的主要标准
3、4设计用于特异性扩增 SSB/La 的一对引物。这对引物的 5分别添加了合适的内切酶位 点序列，便于使克隆基因片断与表达型质粒载体 PGEX2T 定向拼接并确保读码框架的正确。引物交中国科学院细胞研究所合成、纯化。 3端引物为：5GGCGAATCCCTGGTCTCCGGCACCATT 3 EcoRI 5端引物为：5AAGGGATCCTACCGACTTTTACCACTA BamHI Hela 细胞培养及其 RNA 的抽提参照异硫氰酸胍法进行5 。 取细胞总 RNA 10 mg，3端引物 0.8 mol/L(终浓度，以下同)，70 加热 5 分钟，然后依 次加入 RNasin 20 l，4 种 d
4、NTP 各 1 mmol/L，AMV 逆转录酶 25 l 以及逆转录反应缓冲液， 总体积 25 l，42 保温 1 小时。在上述逆转录反应产物 25 l 中加入MgSO4 6 mmol/L， 4 种 dNTP 各 200 mmol/L，5端引物 0.2 mol/L 以及 Taq DNA 聚合酶缓冲液，混匀后 100 加热 5 分钟。冷却至 72 加入 Taq DNA 聚合酶 2 l。PCR 热循环条件：变性 94 持续 30 秒， 退火 65 持续 30 秒，延伸 72 持续 2 分钟，共计 30 个循环，最后在 72 中延伸 10 分钟。扩 增产物经溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳检测。 1.3 SS
5、B/La 重组体的构建与鉴定：用 BamHI 和 EcoRI 内切酶双酶切表达载体 PGEX-2T 和 PCR 产物，经 T4DNA 连接酶作用，室温过夜。将连接产物用 CaCl2 法转导入 JM 109 菌株中，并涂 布于 LB/Amp 平板，37 孵育过夜。挑取 LB/Amp 平板上菌落，提取质粒，用BamHI 和 EcoRI 内 切酶双酶切，并经琼脂糖凝胶电泳，鉴定能切出1.2 Kb 酶切小片段的重组克隆，以备进一 步表达鉴定。提取重组克隆的质粒，用上述特异性引物经 PCR 扩增，产物经琼脂胶糖电泳。1.4 DNA 测序：将上述所选克隆用 Taq 酶 Sanger 双脱氧链末端终止法测序
6、6 。 2 结 果 2.1 SSB/La cDNA 的克隆：逆转录PCR 反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示，在分子量约为 1.2 Kb 的位置可见清晰的特异性扩增条带。用酶切法和 PCR 法证实载体 PGEX-2T 中含有以正 确方向嵌入，符合预期长度的目的基因 SSB/La cDNA。 2.2 DNA 序列测定：DNA 测序结果表明该克隆为 SSB/La cDNA，与EMBL 库中检索到的人 SSB/La 基因序列相一致。本研究得到的人 La cDNA 克隆，包含 1 224 bp 的开放阅读框，由此推断的 蛋白质含408 个氨基酸，分子量为 46 784。与国外报道7的人 La cDNA 克隆
7、相比，在 a.a.666 位的 AG，在 a.a.723 位的 TC，而所编码的氨基酸均不变。 3 讨 论 本课题在对靶基因(SSB/La 的核苷酸序列)进行 cDNA 克隆中，采取逆转录PCR 这一简捷有效 途径代替以往用自身抗体或合成寡核苷酸探针筛选 cDNA 文章的较繁琐的经典基因克隆。 设计引物时采用计算机软件进行辅助分析，选择了 SSB/La cDNA 中没有的，而表达载体 PGEX -2T 内有的单个酶切位点 EcoRI和 BamHI，利用双酶切位点将 SSB/La cDNA 定向插入 PGEA-2T ，避免了 DNA 插入的反向或串联、自联等问题。 产生的 PGEX-2T-La
8、重组体经双酶切鉴定和 PCR 法来鉴定重组体的正确性。经测序鉴定，本 研究获得的克隆中含有 SSB/La 基因的真实拷贝。我们所获得的克隆序列与国外研究结果的差 异可能是由于 cDNA 文库来源的不同，由于同一基因在不同细胞的不同表达，也可能是由于反 转录酶作用的差异。 选用 PGEX-2T 作为表达载体，其优点是：将目的基因与 PGEX-2T 定向克隆并导入大肠杆菌表 达，可产生 GST 和 La 的融合蛋白，分离纯化简便，可用谷胱甘肽亲合层析柱分离融合蛋白； 而在 GST和 La 之间有凝血酶酶切位点，在体外可切除 GST 而得到 La 抗原，可用于抗原表位研究 ，消除 GST 对 La
9、抗原性检测的干扰。而细菌蛋白酶对重组抗原降解减少，因而表达产量较高 。 重组 SSB/La 抗原能特异识别自身免疫病患者抗血清，因而可用重组抗原作检测以辅助诊断， 也可分析其片断的抗原性以了解其抗原表位8，9 。下一步，我们将对构建的重组 体诱导表达蛋白，并对其理化性质和生物学活性进行鉴定。我们希望通过对 SSB/La 重组抗原 的精确定位分析，从分子免疫学角度为某些自身免疫病的诊断和鉴别诊断提供依据，为制备 重组抗原用于临床检测奠定基础。 注释：本课题为上海市启明星基金资助项目(94QB14002) 作者单位：200003 上海，第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心 参考文献 1 Rei
10、chlin M.Autoantibodies to the RoRNP particles.Clin Exp Immunol,1995 ,99:7-8 2 Veldhovea HA,Meilof JF,Huisman JG,et al.The development of a quant ative assay for the detection of anti-SSA/Ro and anti-La/SSB autoantibodies us ing purified recombinant proteins.Immunol Methods,1995,151:177-181 3 邓安梅，仲人前
11、，孔宪涛.SSA/Ro 抗原研究进展及临床应用.中国免疫学杂志， 1997，13：92-94 4 金冬雁，黎孟枫，译.分子克隆.第 2 版.北京：科学出版社，1996.629-650 5 卢圣栋，主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993.293 -298 6 Itoh K,Itoh Y,Frank MB.Protein heterogeneity in the human Ro/SSA ribon uc1eoproteins:the 52 000 and 60 000 Ro/SSA autoantigens are encoded by separate genes.J Clin Invest,1991,87:177-186
