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1、 技术支持：技术支持：01058851919616 订购：订购：01058851919618 Email： 北京康为北京康为世纪生世纪生物科技有限公司物科技有限公司 PurePlasmid Midi Kit 高纯度质粒中提试剂盒 Version 042820102.1 I 组分说明 Catalog no. CW0502 CW0502A Number of preps. 50 6 Buffer P1 30 ml 5 ml Buffer P2 30 ml 5 ml Buffer N3 40 ml 5 ml Buffer PB 30 ml 5 ml Buffer PW(concentrate) 1
2、5 ml 2 ml Buffer EB 15 ml 1 ml RNase A(10mg/ml ) 600 l 100 l Spin Column CL 50 6 Collection Tube(2ml) 50 6 Protocol 1 1 II 保存条件 该试剂盒室温干燥条件下（15-25）可保存一年，更长的保存时间可置于 2-8。若溶液产生沉淀，应在使用前置于 37下溶解沉淀。 单独包装的 RNaseA 可室温(15-25)保存， 更长时间保存置于 2-8， 加入 RNaseA 后的 Buffer P1置于 2-8保存，可以稳定保存半年。 III 产品简介 本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，通过
3、新型离心吸附柱在高盐浓度下高效、专一结合溶液中的 DNA，提取率达 85%90%。本试剂盒提取的质粒纯度高，质量稳定，最大限度的去除杂质蛋白和细菌中其它有机化合物的污染，一次可处理5-15ml 菌液。所得质粒可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化、文库筛选、体外翻译、转染一些常规的传代细胞等。 IV 注意事项 1. Buffer P1 在使用前先加入 RNase A（将试剂盒中提供的 RNase A 全部加入） ，混匀，置于 28保存。 2. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在 Buffer PW 中加入无水乙醇。 3. 使用前请先检查 Buffer P2 和 Buffer
4、 N3 是否出现浑浊，如有混浊现象，可在 37水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。 4. 注意不要直接接触 Buffer P2 和 Buffer N3，使用后应立即盖紧盖子。 5. 所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为 12,000 rpm(13,400g )。 6. 提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。 技术支持：技术支持：01058851919616 订购：订购：01058851919618 Email： 北京康为北京康为世纪生世纪生物科技有限公司物科技有限公司 V 操作步骤 1. 取5-15 ml过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000 rpm(13,4
5、00g ) 离心1分钟，尽量吸弃上清。 注意：质粒拷贝数较低或10kb时，可以通过二次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，同时后续所加试剂Buffer P1、P2及N3的量需加倍。 2. 向留有菌体沉淀的离心管中加入500 l Buffer P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。 注意：如果菌块未彻底混匀，将会影响裂解效果，使提取量和纯度偏低。 3. 向离心管中加入500 l BufferP2，温和地上下颠倒混匀68次，使菌体充分裂解。此时菌液应变得清亮粘稠。所用时间不应超过5分钟，以免质粒受损伤。 注意：不要剧烈震荡，以免造成所提质粒中基因组DNA污染
6、。如果溶液未变得清亮，提示可能菌量过大，裂解不彻底，应减少菌体量。 4. 向离心管中加入700 l Buffer N3，立即温和地上下颠倒混匀68次，此时出现白色絮状沉淀。 注意：Buffer N3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。室温放置时间不宜超过5分钟，以免损伤质粒。 5. 12,000 rpm (13,400g )离心10分钟，吸取上清，加入到已装入Collection Tube的Spin Column CL中， 注意不要吸出沉淀。 6. 室温放置1-2分钟，使质粒DNA与吸附柱充分结合。12,000 rpm (13,400g)离心1分钟，倒掉Collection Tube中的废液，
7、将Spin Column CL 放回Collection Tube中。 7. 向Spin Column CL加入500 l Buffer PB，12,000 rpm (13,400g )，离心1分钟， 倒掉Collection Tube中的废液，将SpinColumn CL重新放回Collection Tube中。 注意： 如果宿主菌是endA-宿主菌 （DH5， TOP10 等） ， 此步可省略。 如果宿主菌是end A+宿主菌 （TG1， BL21， HB101， JM101， ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步，如果提取低拷贝质粒推荐采用此步。
8、 8. 向Spin Column CL中加入700 l Buffer PW （请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (13,400g )离心1分钟，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin Column CL重新放回收Collection Tube中。 9. 向Spin Column CL中加入500 l Buffer PW （请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (13,400g )离心1分钟，倒掉Collection Tube中的废液，将Spin Column CL重新放回收Collection Tube中。 10. 12,000 rpm (13,
9、400g) 离心2分钟，倒掉废液。将Spin Column CL置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的Buffer PW。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的Buffer PW去除，Buffer PW中乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）。 11. 将Spin Column CL置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300 l Buffer EB，室温放置2-5 分钟，12,000 rpm(13,400g )离心2 分钟，将质粒溶液收集到离心管中。-20保存质粒。 注意： 1）为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到Spin Column CL中，重复步骤11。Buffer EB在6570水浴预热，适当延长吸附和洗脱的时间，可以增加提取效率。 2）洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100 l，体积过小影响回收效率。
