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1、Real-time qPCR 手册- 手把手教你从菜鸟到高手Real-timeReal-time qPCRqPCR 手册-手把手教你从菜鸟到高手目录前言. 3 3一、Real-timeReal-time qPCRqPCR 发展史.3.3二、Real-timeReal-time qPCRqPCR 概述.3.3三、Real-timeReal-time qPCRqPCR 实验设计88四、Real-timeReal-time qPCRqPCR 操作过程.9.9五、Real-timeReal-time qPCRqPCR 数据分析.16.16六、Real-timeReal-time qPCRqPCR 常见
2、问题分析.19.19Real-timeReal-time qPCRqPCR 手册-手把手教你从菜鸟到高手Real-timeReal-time qPCRqPCR 手册-手把手教你从菜鸟到高手前言由于 Real-timeReal-time qPCRqPCR 的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及 RT-PCRRT-PCR 的实验，也基本上被 real-timereal-time qPCRqPCR所代替。由于 real-timereal-time aPCRaPCR 输出的数据不同于常规的 PCRPCR 电泳检测，很多没有做过 real-timereal-time
3、qPCRqPCR 的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。本文就从real-timereal-time qPCRqPCR 的发展史说起，包括 real-timereal-time qPCRqPCR 的原理，实验设计，实际操作（以 ABIABI StepOneStepOne 仪器，和北京百泰克生物技术有限公司的试剂为例），数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解 real-timereal-time qPCRqPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-timeReal-time qPCRqPCR 发展史Real-ti
4、me qPCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时检测。由于在 PCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的 PCR 的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。设在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP 检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。在 Real-time qPCR 技术的发展过程中，定量 PCR 仪的发展起了至关重要的作用。1995 年，美国 PE 公司（已经并入 Invitrogen 公司）成功研制
5、了 Taqman技术，1996 年推出了首台荧光定量 PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过 Ct 值进行数据分析。从而荧光定量 PCR 获得广泛应用。现在的定量PCR 仪有 ABI 7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlus TM、StepOne TM、PRISM StepOne TM 系列；BIO-RAD 的 CFX96、iCycler iQ5、MyiQ、MJ ResearchChromo4 TM Opticon 系列；Stratagene Mx TM 系列；Roche LightCycler系列；Eppendorf Masercycler；C
6、orbett Rotor-Gene TM；Cepheid SmartCycler 和 BIOER的 LineGene 系列（考虑到其是日资子公司，还是不并入国内企业吧！）。随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的 real-time PCR仪器生产比如西安天隆科技公司的 TL 系列仪器。二、Real-timeReal-time qPCRqPCR 概述1.1. Real-timeReal-time qPCRqPCR 原理实时 PCR 就是在 PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对 PCR 进程进行实时Real-ti
7、meReal-time qPCRqPCR 手册-手把手教你从菜鸟到高手检测。一般来讲，定量 PCR 仪包括：实时荧光定量 PCR 仪主要由样品载台、基 因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。常用的荧光激发方式有两种：卤钨灯和 LED；荧光检测元件常用两种方式：光电倍增管和冷光 CCD 摄像机，光单色元件有滤光片和光栅。在实时 PCR 扩
8、增过程中，荧光信号被收集，转化为成为扩增和熔解曲线。具体数据就是基线，荧光阈值和 Ct 值。（From Invitrogen）2.2. Real-timeReal-time qPCRqPCR 的数学原理也就是说为什么 Ct 值跟初始模板的量成正比？首先来看一个 real-timeqPCR 中的重要参数（具体的后面会讲到）Ct 值（Ct value），阈值（threshold），和基线（baseline）。一般来讲，第 3-15 个循环的荧光值就是基线，是由于测量的偶然误差引起的。阈值一般是基线的标准偏差的是 10 倍。在实际操作中也可以手动调节，位于指数期就可以。Ct 值就是荧光值达到阈值时候
9、的 PCR循环次数。所以是一个没有单位的参数。CtReal-timeReal-time qPCRqPCR 手册-手把手教你从菜鸟到高手那么为什么说 CtCt 值跟初始模板的量程正比呢？我们来看 PCRPCR 的扩增方程：从线性方程上看，斜率（slope）为-1/lg(1+E)，所以 E=10-1/slope-1。如果从标准曲线上得到斜率（-3.3），就可以算出扩增效率（0.99）。一般来讲 PCR扩增效率在 90%-110%都是可以用于数据分析的。效率低于 100%，是由于PCR 反应中存在抑制因素；而高于 100%可能一些污染、非特异性扩增或者Real-timeReal-time qPCRq
10、PCR 手册-手把手教你从菜鸟到高手是引物二聚体造成。3.3. Real-timeReal-time qPCRqPCR 的种类根据 real-time qPCR 的化学发光原理可以分为 2 大类：一类为探针类 包括TaqMan探针和 分子信标，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。；一类为非探针类，其中包括如 SYBR Green I 或者特殊设计的引物(如 LUXPrimers) 通过荧光染料来只是产物的增加。3.13.1 TaqmanTaqman 探针法Taqman探针是最早用于定量的方法。就在 PCR 扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸：5端标
11、记一个报告荧光基团，3端标记一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，也就是 FRET 反应；PCR 扩增时，Taq 酶的 53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。而新型 TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。3.23.2 分子信标法分子信标：一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分
12、子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。分子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。Real-timeReal-time qPCRqPCR 手册-手把手教你从菜鸟到高手3.33.3 SYBRSYBR GreenGreen 法SYBR Green I 是一种结合于
13、小沟中的双链 DNA 结合染料，与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreenI 的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm。在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR Green 荧光染料，SYBR Green 荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR Green 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。3.43.4 LUXLUX primersprimers 法LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现
14、定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物 3端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号。Real-timeReal-time qPCRqPCR 手册-手把手教你从菜鸟到高手4.4. Real-timeReal-time qPCRqPCR 和常规 PCRPCR 的区别 实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高精确定量三、Real-timeReal-time qPCRqPCR 实验设计 实验设计其实比实验本身更重要！好的实验设计可以事半功倍，节省时间！尤
15、其做生物实验，一定要查询尽可能完全的相关资料，整理好思路，设计好实验路线。当然实验过程中出现各种各样的变化，但有足够多的背景知识，就可以分析原因，才有可能创新。对于一个 real-timereal-time qPCRqPCR 而言，首先就是实验材料的处理和准备；然后引物设计，这步至关重要，好的引物是实验本身成功的50%50%；进行实验和数据分析（这一部分单独说明）。1.1.实验材料的处理和准备以最基本的基因表达差异分析为例。实验材料分为对照组（CON）和处理组（TRT）。组内要有生物重复，可以数据分析此处理是否有统计意义。在材料收集过程中，尽量避免 RNA 的降解（尤其对于绝对定量的样品）。一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻，然后迅速转移到超低温冰箱保存，但这种方法携带不方便，由于对于异地取材。现在新技术的发展，也有一些非液氮类 的 样
