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1、婴幼儿配方食品和乳粉婴幼儿配方食品和乳粉 L-肉碱的测定编制说明肉碱的测定编制说明1 1、引言、引言L L-肉碱又称肉毒瘤碱或维生素 BT,化学式为 C7H15O3N,分子量为 162.2，化学名 L-羟基-三甲胺丁酸盐，英文名为 L-hydroxy-butyrobetaine。类似胆碱和甜菜碱的结构。L-型具有生命活性，作为婴幼儿配方乳粉的成分之一，已在婴幼儿配方食品和乳粉中广泛使用。目前，L-肉碱的检测方法有很多种，有生物法、化学法、酶法、荧光法、HPLC 法 NMR 法和放射酶法。其中以酶法、荧光法和 HPLC 法较为常用。存在于产品中 L-肉碱主要有两种形态：游离态与结合态，它们具有同
2、等的生理作用。所以测定 L-肉碱的含量必须包括这两种形态。通过试验认为酶比色法测定婴幼儿配方奶粉中的 L-肉碱，具有方法灵敏度高，特异性强等特点。测定结果能反映出样品中 L-肉碱的真实状况，所以，在制定本标准时，采用酶比色法。目前 GB10765-1997、GB10766-1997、GB10767-1997、GB10769-1997 等婴幼儿配方奶粉的国家标准中尚未规定 L-肉碱的的含量。根据目前此类产品的状况，婴幼儿配方乳粉的配方中，有 80%企业都将 L-肉碱作为重要指标进行强化，并制定为企业标准。一般强化后样品中的 L-肉碱含量在 550mg/100g 范围内。为了适应新形势的发展，我中
3、心与上海英特营养乳品有限公司共同起草了 L-肉碱的检验标准。1、任务来源任务来源 任务来源：国家标准化制修订委员会 任务编号：200794444T4692 2、制定标准的必要性和意义、制定标准的必要性和意义L-肉碱有两种光学异构体，即左旋肉碱（L-型）和右旋肉碱（D 型） 。L-型具有生命活性，而（D 型）则是其竞争性抑制剂。而通常所指都是 L-肉碱。L-肉碱作为一种功能性营养物质，广泛的存在于自然界中。大多数动物具有合成L-肉碱的能力。L-肉碱主要存在于动物的肝、肾、脑中。L-肉碱的主要功能是参与动物体内的脂肪代谢。它作为载体将长链脂肪酸从腺粒体膜外输送到膜内，促进脂肪酸的 -氧化，从而促进
4、脂肪的代谢。因此他有如下生理功能：1、减少脂肪，降低体重。2、在运动时帮助身体燃烧脂肪，提高运动的能量、耐力和运动成绩。3、消除过多的乳酸，提高做功能力，促进疲劳的恢复。4、增强心细胞氧化脂肪的能力，降低剧烈运动时心脏的负担。5、减慢人的衰老过程等等。根据 L-肉碱的上述生物特性，开发了很多功能性食品及药物。如用于减肥、健美等的保健食品、运动员的营养补剂、婴儿食品强化营养剂、中老年人的营养补充剂、饲料添加剂、药物等。母乳中的 L-肉碱含量较高，婴幼儿自身合成 L-肉碱的能力较成年人低，所以婴幼儿乳粉中应强化 L-肉碱。而 L-肉碱作为一种婴幼儿食品添加剂，会因它的合成与提取的方式产生质量上得很
5、大差异，可谓鱼目混杂、良莠不齐。L-肉碱虽然具有多种生理功能，但过高或过低度不能起到应有的作用：过高可能对人体产生危害；过低则起不到其应有的作用。特别是国家自实行食品市场准入制度后，根据有关法规性文件，对产品中添加的所有成分都须达到相应标准的要求，所以，只要在企业标准、或包装标识中规定了 L-肉碱含量，都须达到其标准。建立该标准既能为控制产品质量提供依据，也为政府执法提供了必要标准的支持。3 3 起草过程起草过程3.1 前期工作L-肉碱在婴幼儿配方乳品的使用已十年之久。在这种情况下，我们开始着手收集相关资料，研究 L-肉碱检测技术。先后采用 HPLC 法与酶比色法进行研究。 研究内容包括样品前
6、处理技术研究、测定技术研究等。样品处理的研究开始主要针对游离态 L-肉碱。根据有关资料，采用高氯酸沉淀蛋白质后，滤液用氢氧化钠调节 pH 至中性进行测定。此种方式处理的样品测定的是游离态的 L-肉碱。之后根据国外查找的资料，认为 L-肉碱在婴幼儿配方乳粉中约有 30%为结合态，并且其生理作用与游离态等同，所以要改进样品处理。我们根据样品的特点及 L-肉碱的性质，对样品处理技术重新进行实验研究。经多次实验后认为样品首先用高氯酸沉淀蛋白质后，吸取一定量的滤液用 KOH 皂化，使结合态L-肉碱变成游离态，然后再用高氯酸调至中性，效果较好。在测定方法上，我们首先开展了采用 HPLC 法进行测定， 实验
7、结果发现 L-肉碱分离度不好， 且响应信号较小，灵敏度低，不能满足测定该类产品中 L-肉碱的要求。后采用酶比色法进行实验研究，结果发现该方法选择性好、无干扰、灵敏度较高、易于操作、重现性好等特点。由此确定了样品处理采用 KOH 皂化提取、酶比色法的测定方法。由于目前无国家标准，据此我们通过全国乳品标准化中心向国家标准化委会提出国家标准制定的申请。3.2 实验室间验证工作08年6月28-30日全国乳品标准化中心在青岛组织召开了标准制修订工作会议后，将我们提交的标准文本作了详细的研讨。专家一致认为：此方法对于测定婴幼儿配方食品与乳粉中L-肉碱的含量，方法可靠、操作简单、重现性好。并一致通过了下一步
8、的验证工作。根据会议精神，我们立即统一制备了三个水平的标准样品。由于该方法中使用的两种酶全部须进口，且正值奥运会期间无法买到这些试剂，许多实验室不能开展验证工作，所以我们仅邀请到了上海英特尔营养乳品有限公司。通过统计分析各个实验室的检测数据，鉴定结果完全一致。参加验证的实验室一致认为：该方法用于测定L-肉碱，其结果准确可靠，操作简单。所以将该方法整理成为征求意见稿。3.3 制定标准的原则和依据。目前测定产品中 L-肉碱含量的尚无相应的标准，主要参考了相关技术资料及国外大型乳品企业实验室的方法。制定该标准的原则是所制定的方法具有可靠、简便、重现性好及适应婴幼儿配方食品及乳粉等样品。经过我们前期工
9、作，已建立了相应的方法。经实验验证：该方法的准确性、重现性、检出限等完全能满足婴幼儿乳粉要求。4 4标准主要条款的说明标准主要条款的说明4.1 标准名称 L-肉碱有两种光学异构体，即左旋肉碱（L-型）和右旋肉碱（D 型） 。但只有 L-型具有生命活性，具有一定的生理功能。除了奶粉中固有的结合态的 L-肉碱，通常企业强化的多为游离态的 L-肉碱。经过试样前处理最后测得的为两种形态的总 L-肉碱。故将本标准名称确定为 L肉碱的测定。4.2 方法原理该方法是由 Marquis 和 Fritz 于 1964 年首次建立的，经进一步完善成为现在的方法。该方法是以乙酰转移酶为催化剂，在与显色剂进行反应生成
10、黄色物质，以此定量。其反应机理如下：CAT Acetyl-s-CoA + L-Caritine Acatyl-L-carnitine + CoASH() 乙酰辅酶 A L-肉碱 乙酰-L-肉碱 辅酶 ACoASH(I) + DTNB TNB - + CoA-S-NB + H+ ()5,5-二硫代双-2-硝基苯甲酸 5-硫 2-硝基苯甲酸根（黄 色）该法测定肉碱必须具有足够量的乙酰辅酶 A 参与反应()。其次两步反应中必须加入恒定量的 CAT 和 DTNB。CoASH 与肉碱之间是等摩尔关系，利用比色法于 412nm 测定，即可间接测定出肉碱的含量。4.3 试样前处理L-肉碱为水溶性物质，试样经
11、过水提取后，可用高氯酸沉淀蛋白质。然后将滤液皂化，使结合态的 L-肉碱游离出来。在此之前曾省略了皂化过程，使结果偏低。经大量实验证明未经皂化的试样的胆碱测定值大约要低 30%左右。4.4 试剂在本标准中有很多不常见的试剂，如 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸和两 种酶乙酰辅酶 A 及乙酰转移酶。本方法验证试验所用的这三种试剂均为进 口试剂。为保证乙酰辅酶 A 和乙酰转移酶的活性，都需要冷藏，且每次要先用 现配制。因为其价格昂贵，已经将其用量降至最低。L-肉碱标准品同样为进口试剂，其储备液可以在 4冰箱中冷藏 1 个月。而其工作液则只限当天使用。 因为该反应是酶反应，所以整个反应都与温度有着
12、密切的关系，所以在酶 显色反应时要将所有试样和试剂都放置至室温，方可得到真实测定值。4.5 操作过程 4.5.1 试样处理 试样处理严格按照标准中的规定进行，在沉淀蛋白质时，可根据蛋白质含 量适当调整沉淀剂高氯酸的用量。试样在静止过夜过程中会使蛋白质充分沉淀。4.5.2 标准曲线绘制 每批样品必须绘制一条标准曲线。事实上，只要酶的活性没有失效，该显 色反应还是相当稳定的，每次的标准曲线都能很好地复现，并且线性很好。 L-肉碱标准曲线及吸光值回归方程与相关系数 L-肉碱含量ug/ml1.60723.1366.2729.40816.072吸光值0.0700.1400.2720.4100.690回归
13、方程Y= 0.0428X+0.0004相关系数 r0.9999由此可见在 016.072ug/ml 内符合比尔定律。4.6 分析结果与计算通过从标准曲线上查得样液中 L-肉碱含量，可计算出试样中 L-肉碱的含量。4.7 最低检出限根据 GB/T5009.1-2003，中 A 2.2 吸光法和荧光法中的计算方法。计算检出限： 式中：b标准曲线回归方程中的斜率。s二次空白值的标准偏差;K根据一定置信度确定的系数,按 3 计算。确认试样检出限为 2.0mg/100g。4.8 准确度的计算回收率的计算编号测定值（mg/100g）添加量(mg/100g)回收率平均回收率11.9401.832105.9%
14、25.4695.49699.5%38.8419.1696.5%100.63由此可见回收率很好，在 96.5%105.9%之间，平均为 100.63%。5 5实验室方法验证实验室方法验证由于事前很多企业没有开展该项目的检验，又正值奥运召开前夕，购买进口试剂比较困难，所以只有上海英特乳品有限公司参与了实验室间的验证工作。验证结果如下：5.1 精密度的计算国家乳品检测中心与上海英特乳品有限公司选择三个不同水平的婴幼儿配方奶粉进行测定，结果如下：表 1 L-肉碱测定原始数据 （mg/100g）水平实验室测定次数123131.8321.2918.09232.2220.5218.26332.1721.15
15、18.92432.3122.7219.02533.0920.3919.35国家乳品质量技术监督检验中心(1)633.1320.6918.69129.5919.9517.5231.6219.7816.86329.5419.3917.84417.32517.44上海英特营养乳品有限公司(2)617.68表 2 L-肉碱的单元平均值 （mg/100g）水平 j123实验室 iyijnijyijnijyijnij132.46621.13618.726230.25319.71317.446表 3 L-肉碱含量的标准差水平 j123实验室 iSijnijSijnijSijnij10.5360.8660.4
16、8621.1930.2930.3465.1.1 测试结果的一致性和离群值的检验用柯克伦检验检验实验数据是否有歧离值和离群值。根据 GB/T6379.20047.3.2.1 中的规定：如果检验统计量小于或等于 5%临界值，则接受检验的项目为正确值；如果检验统计量大于 5%临界值， ，但小于或等于 1%临界值，则称被检验的项目为歧离值。但可参与计算。如果检验统计量大于 1%的临界值，则被检验的项目称为立群值。予以剔除。在本实验中，P=2,n=6 柯克伦检验 1%临界值为 0.937， 5%临界值为 0.877。柯克伦检验统计量： piissC122 max表 4 柯克伦统计量计算值：水平2 is2 is实验室柯克论统计量
