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1、3.1.2.1.1 试剂配方试剂配方试验中所用的试剂配方如下：1) CTAB-free 缓冲液：1L试剂名称所需量终浓度1.0mol/ L Tris-HCl （pH 8.0）200ml200mmol/ L 0.5mol/ L EDTA（pH 8.0）100ml50mmol/ L NaCl14.6g250mmol/ L2) 3CTAB 提取缓冲液：1L试剂名称所需量终浓度CTAB30g3%(W/V) 1.0mol/ L Tris-HCl （pH 8.0）100ml100mmol/ L 0.5mol/ L EDTA（pH 8.0）50ml25mmol/ L NaCl81.76g1.4mol/ L3
2、) 1TE：1L试剂名称所需量终浓度1.0mol/ L Tris-HCl （pH 8.0）10ml10mmol/ L 0.5mol/ L EDTA（pH 8.0）2ml1mmol/ L 3.1.2.1.2 DNA 提取提取1) 取样：在甜叶菊生长的早中期，于田间按取样顺序取顶部幼嫩叶片 6 片左右，然后置于-70冰箱保存。2) 研磨：每个样品取 0.2g（约 3 片）左右细嫩叶片放入研钵中，立即加入适量液氮，迅速研磨成极细的粉末（可加入液氮重复一次） 。在粉末回潮以前迅速装进已经用液氮预冷的 2ml 离心管中。3) 冰浴：在离心管中加入 4预冷的 1.5mL CTAB-free 缓冲液及 2%
3、-巯基乙醇，振荡混合后冰上放置 20min。4) 裂解：在 4下 12000rpm 离心 5min，弃上清，加入 700ul 预热至 65的3CTAB 提取缓冲液和 2% -巯基乙醇，重悬沉淀，65水浴 1h，每隔10min 左右振荡一次。5) 抽提：将离心管从水浴锅中取出，冷却至室温，加入等体积的氯仿：异戊醇（24 : 1） ，缓慢翻转混匀约 5min。在 4下 12000rpm 离心 10min，将上清液转至另一支有编号干净的 2ml 离心管中。6) 沉淀：在离心管中加入等体积-20预冷的无水乙醇（或在离心管中加入 0.6倍体积预冷的异丙醇） ，轻轻混匀，-20放置 30min 以析出沉淀
4、。在 4下12000rpm 离心 10min，弃上清。7) 溶解：加入 500ul 1.0mol/ L NaCl 溶液，轻摇至沉淀重新溶解。8) 再次沉淀：在离心管中加入 0.6 倍体积预冷的异丙醇(或在离心管中加入等体积-20预冷的无水乙醇)，轻轻混匀，-20放置 20min。在 4下 12000rpm离心 10min，弃上清。9) 洗涤和保存：沉淀出的 DNA 用 70%乙醇清洗两次，室温干燥 30min，溶于50L TE 缓冲液中，-20保存备用3.2.2.2 PAGE 胶的制作胶的制作聚丙烯酞胺凝胶电泳试剂准备：1）30%Acr-Bis：290g 丙烯酞胺，10 克 N, N-甲叉二丙
5、烯酞胺，加 ddH2O 至1000m1，放于 4保存。2）10%的过硫酸胺（AP）：1 克过硫酸胺溶于 10ml 双蒸水，放于 4保存。3）50TAE：242 克 Tris-Base，37.2 克 EDTA 加 ddH2O 约 800m1，溶解后加入冰乙酸 57.1ml，加 ddH2O 定容至 1000ml。PAGE 胶的制作过程为： 用洗涤剂将两块玻璃板彻底洗净并晾干； 将胶条放置于大玻璃板两侧，小心的将小玻璃板扣在上面； 将两块玻璃板垂直放到封胶槽中并紧贴挡板，小玻璃板朝外； 往封胶槽中加入融化好的 1%琼脂溶液，待凝固。 按 8ml30%丙烯酞胺凝胶母液+21mlddH2O + 600l
6、 50TAE + 300l AP + 30l TEMED 的比例配制凝胶液混匀，沿玻璃棒将溶液注入两块玻璃板空隙中，直至灌满到玻璃板模具的顶部。将梳子的边缘用擦净后小心的插入（最好先以一端先插入，然后全部插入，可以防止产生气泡） 。 聚合 1h 左右即可进行电泳。3.2.2.3 PAGE 胶（胶（8%）凝胶电泳）凝胶电泳1. 将胶板从封胶槽中取出，小心去除气泡；2. 用自来水将胶板两面洗净，在下槽加入约 150ml 1TAE 后将胶板装入电泳槽中；3. 上槽加入约 350ml 1TAE，小心的拔出梳子；4. 在 PCR 产物中加入 0.25 倍体积的上样缓冲液，点样 2l，小心不要串样，尽快点
7、完；5. 插上电线，以恒电压 120V 电泳 22.5h，终止电泳。3.2.2.4 PAGE 胶的染色及拍照胶的染色及拍照银染法试剂准备：染色液（0.1%AgNO3）：1g AgNO3加至 1L ddH2O 中。显色液（15g/LNaOH，0.019%NaHCO3，0.03%甲醛）：称取 15gNaOH 和0.019gNaHCO3溶于约 800ml ddH2O 中，加入 3ml 甲醛，定容至 1L。此溶液为现配现用的。固定液（10%冰醋酸）：100ml 冰醋酸加进 900ml ddH2O 中。染色过程：1. 剥胶：用水将粘在玻璃板上的胶冲进准备好的染色盆中，将水沥干；2. 染色：往装有胶的染色
8、盆中加入约 100ml 染色液，放在摇床上振荡 15min；3. 漂洗：去除染色液，用 ddH2O 轻轻振荡清洗两遍，清洗动作尽量快。4. 显色：将约 100ml 显色液倒入染色盆，放在摇床上振荡直至条带全部出现并全部清晰可见。5. 固定：将显色液倒出，加入约 100ml 固定液放置 2min 左右，再用 ddH2O 清洗两遍即可用相机拍照。实验注意事项：1.研磨过程要快，带粉末未回潮前就转移到有编号的试管中，研磨好的样品要放在冰箱中或插入冰中，由于甜叶菊极易被氧化，一般不要在空气中暴露太长时间，液氮使用应节约，不能过于浪费，一般研磨 2-3 次即可，选取叶片尽量选新鲜，不干净的叶片用清水冲洗
9、后，用纸吸干水份后再研磨。2.加液体时要先看移液枪是否在所需量程范围内，在提取 DNA 过程中只有一步需要用到预热，水浴有一次，用完水浴锅要记得关掉。提取上清时应尽量不要取到下面的沉淀。3.沉淀有两种试剂用异丙醇沉淀，去除蛋白质等有机成分效果较好用无水乙醇沉淀，去除无机离子，沉淀出来的 DNA 比较紧实。去除上清时要小心，不要把沉淀倒出去。4.70%乙醇洗 DNA 过程绝不能省，乙醇能洗掉有机以及一些无机杂质，保证后面 PCR 试验的成功与否。5.乙醇没有完全风干后不能加 TE 溶解，或导致 DNA 不能溶解，并且之后 PCR反应也会受到影响。6.各种试剂，尤其是公共试剂（从其他实验室拿过来的） ，用哪里拿来用完后放回哪里。使用别人的试剂仪器要和别人先说，经过允许后方可使用。最后检查离心机以及其他用到的仪器是否关掉。7.实验过程中遇到的问题要学会总结，要做到每做一次都要保证成功，不能出现纰漏。走后注意实验室门窗是否关闭，空调是否关掉
