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1、病毒变异与病毒感染性疾病的诊治 第二军医大学微生物学教研室 潘卫自然界的任何物种都存在变异，变异是生物适应环境和维持生存的一种重要方式，是生物进化的规律。但不同物种变异速率不一，病毒是变异率比较高的微生物。一方面病毒的复制频率很高，遗传物质很容易在复制过程中发生突变；另一方面病毒在宿主体细胞内复制繁殖，必然要遭到宿主免疫系统的攻击（称之为免疫压力），因而变异则成为逃避免疫杀伤的最好方式。从医学病毒学的角度考虑，病毒变异不仅为病毒感染性疾病的治疗、预后构成不利，同时还影响到病毒感染的正确诊断，包括免疫学诊断和基因诊断。本文介绍病毒变异的一些基本问题，已期提高对病毒感染性疾病的认识、提高临床诊治水
2、平。病毒遗传与变异的基本规律一、名词解释株： 指同种病毒的不同系别或不同的分离株，如来源于不同地区或病人的病毒。准株（quasispecices）：指某株病毒在同一宿主内发生变异所产生的变异株，应注意与变异体区别。型：指同种病毒的不同血清型（例如各种抗体中和表型）和基因型。变异体： 指表型与原始野生型不同的病毒，但其变异的遗传基础尚不清楚。二、病毒突变体的起源自发突变 某些病毒的基因突变率可高达 10-310-4/nt（例如逆转录病毒 HIV），而有些病毒突变率仅为 10-810-11（如疱疹病毒），相当于细胞 DNA 的自发突变率。这种差别是由基因组复制的机制决定的。在复制过程中，RNA 依
3、赖的 RNA 聚合酶的错误率通常要高于 DNA 依赖的 DNA 聚合酶。一些RNA 病毒聚合酶的确具有校对功能，但总的说来，大多数 RNA 病毒的突变率要远远高于 DNA 病毒。对病毒而言，突变具有双重作用，病毒突变可使其抗原性发生改变，从而逃逸免疫应答，但大多数突变是有害的，并会产生许多缺陷颗粒。HIV 的突变率可达到 10-310-4/nt，它的基因组长约 9.7Kb，因此，在每一次复制每个基因组拷贝中就有 0.99.7 处发生突变。所以在这种情况下，所谓“野生型”病毒，实际上是由占大多数暂时未发生突变的类型组成，它们的作用主要是保持病毒在复制过程中的动态平衡（即基因组的数量平衡），而那些
4、分子变异体的混合物则被称为准株。其它 RNA 病毒，如细小核糖核酸病毒、丙型肝炎病毒等也存在这种现象。虽然大多数突变类型是非感染性的或者对其生存极为不利的，并很快被清除，但自发突变却是病毒进化的重要动力。诱发突变 许多诱变剂能引起病毒体的突变。诱变剂大体上可分为两类：第一类：体外诱变剂，直接对核酸进行化学修饰，不影响核酸复制。如亚硝酸、羟胺和烷基化合物（如亚硝基胍）；第二类：体内诱变剂，需进行代谢活化，它们可掺入到新复制的核酸中，并在不断的复制过程中诱发突变。包括：碱基类似物，可诱发转换（即嘌呤嘌呤和嘧啶嘧啶置换，如 ATGC 和 CGTA），也可诱发颠换（即嘌呤嘧啶和嘧啶嘌呤置换，如 ATT
5、A 和 GCCG），其原理是碱基类似物取代原有硷基而掺入到核酸中，导致碱基错配；碱基嵌入剂（如吖啶染料），嵌于碱基之间，诱发插入或缺失；紫外线，可诱发嘧啶二聚体的形成，该二聚体可被光复活酶识别而解聚，该过程是一个易错修复过程，可导致较高的突变频率。紫外线也可造成 RNA 改变，但其作用机制尚不清楚。现代分子生物学技术可以对病毒基因组进行突变，如直接诱发寡核苷酸突变和基于 PCR 的基因突变技术已得到广泛应用。现在结合酶消化技术（引起基因缺失）和接头扫描技术（形成基因插入），可以在病毒基因组的任何特异性位点，准确安全地诱导出几乎任何类型的突变。这类突变可成为人工突变。三、病毒突变的类型病毒突变体
6、的表型取决于其突变类型，也取决于在基因组内发生突变的部位。生化标志物基因突变：这类突变包括：耐药基因突变，导致病毒毒力改变的特异突变；形成多态性，使蛋白质和核酸电泳迁移率发生改变以及对灭活剂的敏感性改变。缺失突变：在某些方面与无义突变相似，但可以是一个或多个病毒基因缺失，也可以是基因组中非编码调控区（如启动子等）的缺失。自发缺失突变体通常可在病毒群体中累积，生成大量缺陷-干扰（D.I.）颗粒。尽管这些颗粒不具有感染性，但仍有一定的遗传学上的意义，有人认为它们在某些病毒感染过程中以及发病机理方面起着重要作用。通过重组，可以使基因缺失病毒回复突变为野生型病毒，但发生频率通常比较低。以下就突变类型的
7、有关名词作解释宿主范围：既可指整体动物宿主又可指体外宿主细胞类型。用琥珀抑制子细胞已分离到宿主的条件突变体（主要针对噬菌体，也针对体外动物病毒）。无义突变：它是由某种蛋白的编码序列突变为任一种翻译终止密码子所致（终止密码子有三种：UAG，称琥珀；UAA，称赭石；UGA，称乳白石），结果翻译终止，生成该蛋白质的氨基末端片段产物。噬菌斑形态：当病毒突变体的复制较野生型快时，可形成大的噬菌斑；反之，则形成小的噬菌斑。噬菌斑的大小常与温度敏感型表型有关。温度敏感型（temperature-sensitive，t.s.）： 是指真正的“热敏感型”突变体。温度敏感型突变通常是由于蛋白质的错义突变所致（即氨
8、基酸置换），导致蛋白质的大小和构象都发生细微的改变，使其在可接受的低温条件下能够发挥功能，而在不可接受的较高温度下失活。多年来已分离到某些病毒（如呼吸道肠道病毒，流感病毒）的许多 t.s.突变体。冷敏感型（cold-sensitive，c.s.）： 这种突变体与 t.s.突变体性质相反。c.s.突变体对噬菌体和植物病毒非常有用，因为后两者的宿主细胞可在低温下增殖。但 c.s.突变体对动物病毒用处不大，因为动物病毒的宿主细胞在明显低于正常温度时通常不能存活。然而，由于呼吸道病毒（如流感病毒）是在上呼吸道细胞内复制，该处温度比身体的其他部位稍低，因此呼吸道病毒的某些 c.s.突变体可能被弱化（即毒
9、力降低），这样它们就有望成为潜在的疫苗株，这一点已引起了人们的兴趣。回复突变： 是指病毒维持正常状态的一种有效的突变类型。上述多数类型的突变都可发生回复突变，一种是发生简单的“复原”（即对初次突变的校正）；另一种是第二位点“补偿突变”，在这种情况下，突变可能偏离了初次突变部位，甚至不发生于初次突变所在的基因上。四、病毒间相互作用（一）病毒的抑制作用 指一种突变体表型被另一种抑制性突变所阻抑，它既可发生于病毒基因组内，也可发生于宿主细胞基因组内。这种现象在原核系统中较具代表性。最近，在动物病毒中（例如呼吸道肠道病毒、牛痘病毒、流感病毒等）也找到了例证。抑制作用可能也具有重要的生物学意义，可以使病
10、毒克服突变的有害作用，从而可以被正向筛选出来。（二）病毒遗传物质的相互作用 包括：互补作用：即病毒超感染过程中基因产物间的相互作用，其结果是一种或两种亲本病毒产量增加，而两种病毒在基因水平上并未改变。在这种情况下，一种病毒为另一个存在某种功能缺陷的病毒提供了该种功能基因产物；重组：是在超感染过程中病毒基因组间自然的相互作用，其结果是产生了两个亲代病毒基因组中都不存在的重组基因；再活化：是指由非感染的亲代病毒基因组产生有感染性的（重组）子代病毒的过程。此过程在体外已得到证实，并且在体内可能也有重要意义。例如，有人对 AIDS 患者长期临床观察中发现，长期潜伏的缺陷型 HIV 前病毒的拯救可能会增
11、加抗原的多样性，并且对致病起一定的作用。(三)病毒非遗传性的相互作用 杂合现象：例如逆转录病毒是真正的二倍体，具有两个完整的全基因组拷贝；某些 DNA 病毒，如疱疹病毒含有重复序列，因而是部分杂合的。另一些病毒（大多数是有包膜的病毒）的异常包装有时可能会产生杂合的多倍体颗粒（如 10%以上的新城疫病毒颗粒）。干扰现象：一种病毒可干扰另一种病毒对细胞的感染。同源性干扰（即对抗同种病毒）通常是由 D.I.颗粒引起的，颗粒间相互竞争必需的细胞成分而阻断复制。此外，干扰也可由突变类型引起（如显性 t.s.突变）或通过封闭病毒受体所致，此作用是由先感染病毒所产生的受体附着蛋白引起的（如鸟类逆转录病毒）；
12、表型混合：在某些极端情况，一个病毒的基因组被完全包裹于另一病毒（假型）衣壳或包膜中。这种混合使子代病毒具有了某种表型特征（如细胞嗜性），这种特征由掺入到病毒颗粒中的蛋白引起，但其基因组却不发生任何变化。表型混合在裸核壳（无包膜）病毒中（如不同株的肠道病毒），或在彼此不相关的包膜病毒中极易发生。后一种情况是不同的病毒糖蛋白非特异性掺入到包膜引起的，从而产生了混合表型。脓疱性口炎病毒（VSV）很容易形成含逆转录病毒包膜糖蛋白的假型，产生的病毒具有 VSV 空斑形成的特性和逆转录病毒细胞嗜性。病毒变异在病毒感染性疾病中的意义上述病毒变异规律和现象大都来自细胞模型，也的确可以在体内发生，但在体内的变异
13、受到更多因素的影响。分子生物学的发展，极大地推动了病毒感染病的基础和临床研究。目前已经具备充分和可信的手段发现和检测病毒的变异，从而能为我们临床诊断、治疗实践提供有意义的信息，尤其在一些发病率高、危害严重的易慢性化的病毒性感染疾病中（如乙型肝炎、丙型肝炎、HIV 感染等），了解病毒变异规律对于疾病的诊断、病情和预后的判断、治疗时机和方案的选择等都具有重要的意义。一、肝炎病毒的变异及基因分型概述已证实的肝炎病毒有 HAV、HBV、HCV、HDV 和 HEV 五种，对它们的分子生物学特性和致病性等问题已经有相当深入的研究。关于这些病毒的基因变异和分型的问题不仅为是微生物学家和病毒学家所关注，也得到
14、临床学家，尤其是传染病学家和肝脏病学家的高度重视。HAV 为小 RNA 病毒科成员，现已被归入嗜肝 RNA 病毒科。人源 HAV 存在 4 个基因型（型），型间核苷酸同源性85%.不同基因型的 HAV 抗原性相同，因此，HAV 只有一个血清型。HBV 为嗜肝 DNA 病毒科成员，可分为 6 个基因型（基因型 AF）,不同地域、人种的 HBV 基因型可能有着不同的分布。基因型的差异与致病性、抗病毒治疗效果、预后等的关系尚无明确结论，尚待进一步研究。HDV 是一种 RNA 缺陷病毒现被归类于卫星病毒科成员。世界各地 HDV 不同分离株的核苷酸变异在11%17%之间。HDV 可分为 3 个基因型 ，
15、大部分分离株为型，型和型分别在日本和南美多见。HCV 为黄病毒科成员，该病毒变异较大，目前至少存在 6 个以上的基因型。HCV 的基因型与致病、预后、干扰素的治疗等密切相关，需引起高度重视。HEV 为环状病毒科成员，感染后导致急性肝炎，临床表现和发病经过与甲型肝炎有一定差异，比如妊娠妇女感染的死亡率较高；发病者年龄分布不明显；更容易发生瘀胆；重型肝炎的发生率高于甲肝；患病后无终身免疫等等。世界各地的 HEV 分离株可分为 2 个基因型，即缅甸型和墨西哥型，我国、东南亚各国及印度流行的为缅甸型。二、乙型肝炎病毒变异（一）S 基因区变异 S 基因区包括前 S1、前 S2 及 S 基因，分别编码前
16、S1 蛋白、前 S2 蛋白及主蛋白。前 S1 蛋白能调节 HBsAg 的分泌，删除它的第 63-67 氨基酸(aa)或第 83-87aa 可下调 HBsAg 的分泌率，其 C 末端 17 个 aa 的突变也将抑制病毒颗粒释放；它的第 2147aa 是 HBV 与靶细胞上特异受体结合的主要部位，但第 377aa 均参与 HBV 感染靶细胞的过程，删除第 78-87aa 不影响 HBV 的感染性。前 S2蛋白 N 末端的 5 个 aa 是自被感染细胞内分泌完整病毒颗粒所必需的，其余大部分序列对病毒的分泌和感染性的影响不大。HBV DNA 第 3055 核苷酸(nt)约相当于前 S1 起始码下游第 230 碱基，可突变形成终止码，并影响前 S2 起始码，这种突变与 HBV 逃避干扰素治疗和宿主免疫清除有关。HBV DNA 第 2995-3177nt 位于前 S 开放读码框(ORF)内，但其缺失可削弱前 S 的免疫性，但仍能保留与肝细胞的结合位点，有利于 HBV 逃避机体的免疫攻击，形成慢性携带状态。在 HBsAg 家族中，大蛋
