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1、实验九实验九 糖酵解中间产物的鉴定糖酵解中间产物的鉴定 一、目的一、目的 了解用专一性的酶抑抑制剂研究代谢中间步骤的原理和方法，增加对糖醇解过程的感性 认识。 二、原理二、原理 在一系列酶催化下，正常的代谢作用持续向前进行，中间产物的浓度往往很低，不易分 析鉴；若加入某种专一性的酶抑制剂，使中间产物累积。则便于分析鉴定。3-磷酸甘油醛 是糖醇解的中间产物，利用碘乙酸对 3-磷酸甘油醛脱氢酶的抑制，可使 3-磷酸甘油醛不再 向前变化而积累，同时用硫酸肼作稳定剂，使积累的 3-磷酸甘油醛不自发分解。然后用羰 基试剂 2，4-二硝基苯肼与 3-磷酸甘油醛在偏碱性的条件下反应，反应过程可能是先加面 后
2、脱水，生成了 3-磷酸甘油醛-2，4-二硝基苯腙，再加过量氢氧化钠帽形成棕色复合物， 其棕色深度与 3-磷酸甘油醛含量成正比。 三、实验材料、仪器和试剂三、实验材料、仪器和试剂 （一）实验材料：鲜酵母 （二）仪器： 1、离心管：10 毫升3 2、试管：6 支 3、烧杯：1 个 4、玻棒：3 根 5、刻度吸管：1 毫升5，5 毫升2 6、药物天平 7、恒温培养箱 8、离心 机 （三）试剂： 1、5%葡萄糖溶液 2、10%三氯乙酸溶液 3、0002mol/L 碘乙酸溶液 4、056mol/L 硫酸肼溶液：称取 7.28 克硫酸肼，溶于 100 毫升蒸馏水中，这时不易全部 溶解，当入 NaOH 使
3、pH 达 7.4 时则完全溶解。 5、0.75mol/LNaOH 溶液 6、2，4-二硝基苯肼溶液：称取 0.1 克 2，4-二硝基苯肼，溶于 100 毫升 2mol/LHCl 溶液中， 贮于棕色备用。 四、操作步骤： （一）加实验材料和试剂： 取 3 支 10 毫升离心管，编号，分别加入鲜酵母 0.2 克，再按下表加入试剂：管号5%葡萄糖 （毫升）10%三氯乙 酸（毫升）0.02mol/L 碘 乙酸（毫升）0.56mol/L 硫 酸肼（毫升）保温后观察 气泡多少5105055005055000加完试剂后，每管中插入一支破棒，搅碎酵母块，混匀，玻棒留在管中。 （二）保温和观察气泡： 将上述三支
4、离心管（连同玻棒管）放在烧杯中，置于 37C 恒温培养箱内，保温 45 分 钟。观察各管生成气泡的量有无不同，为什么？ （三）补加试剂： 在管和管中，按下表补加试剂：管号10%三氯乙酸（毫升） 0.02mol/L 碘乙酸 （毫升）0.56mol/L 硫酸肼 （毫升）10010505加完试剂后，用管中玻棒搅匀，取出玻棒，取出玻棒，静置 10 分钟。 （四）离心： 将上述三支离心管中的内容物分别离心，用相应编号的另外三支试管分别转接相应的 上清液，弃残渣。上清液留用。 （五）显色和观察结果： 取三支管径相同的试管，编号，分别加入上述相应的上清液 0.5 毫升，并按下表规定 加入试剂和处理：管号上清
5、液 （或滤液） （毫升）0.75mol/L 氢氧化钠 （毫升）2，4-二 硝基苯肼 （毫升）0.75oml/L 氢氧化钠 （毫升）颜色深 浅（1）05050535（2）05050535（3）0505室 温 放 置 2 分 钟05室 温 放 置 5 分 钟35每加完一种试剂，各种均要摇匀。最后，观察各管颜色深浅有无差异，哪管最深？哪 管最浅？为什么？ 五、附注： （1）实验材料可采用市售鲜酵母块（家用） （2）本实验虽为定性鉴定，但在称重和量取体积时仍要求相对准确。 （3）应随实验材料来源不同，摸索适宜的保温时间。 （4）试液与 2，4-二硝基苯肼的反应也可在 38C 水浴中进行 10 分钟，但颜色较深，各管 之间差别较小。
