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1、11第五章培养基及设备的灭菌22本章讲述的内容第一节培养基灭菌的目的、要求 和方法 第二节湿热灭菌的理论基础 第三节培养基灭菌的工程设计33第一节培养基灭菌的目的、要 求和方法 一、定义 1，培养基灭菌的定义 是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌 营养体及其孢子，或从中将其除去。工 业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比 除去杂菌更为常用。442，灭菌与消毒的区别 灭菌灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环 境中所有微生物，包括营养细胞、细菌 芽孢和孢子 消毒消毒：用物理或化学方法杀死物料、容 器、器皿内外的病源微生物。55二、培养基灭菌的目的1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： 生产菌和杂菌同时生
2、长，生产菌丧失生产能力； 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生 产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主； 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 杂菌会降解目的产物； 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品； 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象 。662，工业上具体措施包括： 1）使用的培养基和设备须经灭菌使用的培养基和设备须经灭菌； 2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理 ； 3）设备应严密，发酵罐维持正压环境； 4）培养过程中加入的物料应经过灭菌培养过程中加入的物料应经过灭菌； 5）使用无污染的纯粹种子。773，培养基灭菌的目的 杀灭培养基中的微生物，为后续发 酵过程创造无菌
3、的条件。884，培养基灭菌的要求 达到要求的无菌程度（10-3） 尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过 程中，培养基组分的破坏，是由两个 基本类型的反应引起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等 的分解。994，灭菌的方法 化学法 化学药品灭菌法 物理法 干热灭菌法 湿热灭菌法湿热灭菌法 射线灭菌法10105，湿热灭菌的原理 每一种微生物都有一定的最适生长温度 范围。当微生物处于最低温度以下时， 代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当 温度超过最高限度时，微生物细胞中的 原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性 ，使微生物在很短时间内死亡，加热灭 菌即是根据微生物这一特
4、性而进行的。11116，湿热灭菌中的相关定义 杀死微生物的极限温度称为致死温度致死温度。 在致死温度下，杀死全部微生物所需的时 间称为致死时间致死时间；在致死温度以上，温 度愈高，致死时间愈短。 微生物的热阻微生物的热阻：是指微生物在某一特定 条件（主要是温度和加热方式）下的致死 时间。相对热阻相对热阻是指某一微生物在某条 件下的致死时间与另一微生物在相同条件 下的致死时间的比值。1212各种微生物对湿热的相对热阻各种微生物对湿热的相对热阻15病毒和噬菌体210霉菌孢子3106细菌芽孢1.0营养细胞和酵母相对热阻微生物13137，湿热灭菌的优点 蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒 ； 蒸汽有强
5、的穿透力，灭菌易于彻底； 蒸汽有很大的潜热； 操作方便，易管理。1414第二节湿热灭菌的理论基础一，培养基湿热灭菌需解决的工程问题 将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的 总数N（10-3），需要多高的温度、多长的时 间为合理。 灭菌温度和时间的确定取决于： 杂菌孢子的热灭死动力学 反应器的形式和操作方式 培养基中有效成分受热破坏的可接受范围1515二、微生物的热死灭动力学方程 实验证明，微生物营养细胞的均相热死 灭动力学符合化学反应的一级反应动力 学，即： （1） N：任一时刻的活细菌浓度（个/L） t：时间（min） K：比热死速率常数（min-1）NkdtdN=1616取边界条件t0=
6、0，N=N0，对（1）积分得 （2） 或（3）tKNN=0lnKteNN=01717 实验还证明，细菌孢子的热杀灭动力学 与营养细胞的有所不同。它表现为非对 数的死亡动力学。这可能与孢子壁的化 学成分及结构有关。但当温度超过 120C时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆 菌孢子的热杀灭动力学也接近对数死亡 动力学即符合一级反应规律。1818三、温度对K的影响 微生物的热死灭动力学接近一级反应动 力学 它的比热死灭速率常数K与灭菌温度T的 关系可用阿累尼乌斯方程表征 （4）A：频率因子（min-1） E：活化能（J/mol） R：通用气体常数J/（mol.k）RTEeAK/=1919 从（4）可以看出：
7、 活化能E的大小对K值有重大影响。其它条件 相同时， E越高，K越低，热死灭速率越慢。 不同菌的孢子的热死灭反应E可能各不相同。 对（4）两边取对数，得（5） K是E和T的函数，K的对T的变化率与E有关 ，对（5）两边对T的导数，得（6）RTEeAK/=（4）2020AKRTElnln+=（5 5）1/TK（min-1）2121 K是E和T的函数，K的对T的变化率与E 有关，对（5）两边对T的导数，得（6）由（由（6 6）可得出结论：）可得出结论：反应的反应的E E越高，越高，lnKlnK对对T T的变化率越的变化率越 大，即大，即T T的变化对的变化对K K的影响越大的影响越大2ln TRE
8、 dTKd =（6 6）2222试验表明，细菌孢子热死灭反应的E很高，而某些 有效成分热破坏反应的E较低。 将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速 度，缩短灭菌时间，由于有效成分的E很低，温度 的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时间的 显著缩短，有效成分的破坏反而减少317984枯草杆菌孢子343088肉毒梭菌孢子283257嗜热脂肪芽孢杆菌孢子92048维生素B1盐酸盐96232维生素B12E（J/mol）受热物质2323EBS=67000 4.184 （J/mol） EVB=22000 4.184 （J/mol） 将灭菌温度从105C提 高到127 C KVB从0.02（min
9、-1）提 高到0.06（min -1） KBS从0.12（min-1）提 高到40.0（min -1）嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和 维生素维生素B B1 1的的lnKlnK- -1/T1/T图图2424嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16 时，灭菌温度对维生素B1破坏的影响10.01515030.107140100.851130277.6120897511099.99843100维生素B1的损失 （%）达到灭菌程度的 时间（min）灭菌温度（C）2525第三节 培养基灭菌的工程设计一、无菌的标准 根据微生物热死灭方程，要求灭菌 后达到绝对无菌是很难做到的，也 是不
10、必要的。因此在工程设计中常 取N=10-32626二、分批灭菌 1，分批灭菌的设计 在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌 。全过程包括升温、保温、降温三个过程2727孢子热死亡的规律符合NkdtdN=tKNN=0ln()NN NN NN NN NN NN NN221022100lnlnlnlnln+=2828 因为升温、冷却阶段T是时间t的函数，K不 是常数，所以： （7） （8） （9） 式中Kh是保温阶段的孢子比热死亡速度常数=100/lntRTE NNdteA()1221lnttKhNN=dteAttRTE NN=322/ln2929 分批灭菌中几种换热方式的温度-时间变化关系T：介
11、质温度（K）；T0：介质初温（K）；t：时间（min）； h：蒸汽相对于介质的热焓（kJ/kg）；s：蒸汽的重量流率（kg/min） M：介质重量(kg)；Cp：介质比热kJ/(kg.K)； TH：热源温度(K) U：总传热系数kJ/（m2.min.K）；q：传热速率（kJ/min） Cp：冷却剂比热；W：冷却剂流率；TCO：冷却剂温度3030 计算举例 参见 微生物工程工艺原理P226 伦世仪主编生化工程P13。31312，保证间歇灭菌成功 的要素 内部结构合理(主要 是无死角)，焊缝及 轴封装置可靠，蛇管 无穿孔现象 压力稳定的蒸汽 合理的操作方法。发酵罐的接管图发酵罐的接管图32323，
12、培养基间歇灭菌过程中应注意的问题 温度和压力的关系 泡沫问题 投料过程中，麸皮和豆饼粉等固形物在 罐壁上残留的问题 灭菌结束后应立即引入无菌空气保压3333三、连续灭菌的设计 1，连续灭菌的流程图2-5 加热-真空冷却连续灭菌流程生培养液蒸汽喷射加热器维持管膨胀阀急聚蒸发室灭菌好的培养液真空 喷射加热喷射加热-真空冷却流程真空冷却流程3434板式换热器灭菌流程板式换热器灭菌流程图2-6 薄板换热器连续灭菌流程维持段蒸汽加热 段热回 收段水冷 却段生培养液冷却水灭菌好的培养液时间(min)温 度图2-3 培养基连续灭菌过程中温度的变化20s20s2-3min 144273535连消塔-喷淋冷却连
13、续灭菌流程连消塔-喷淋冷却连续灭菌流程图2-4 连续灭菌设备流程示意图 1-配料罐（拌料罐）2-蒸汽入口 3-连消塔 4-维持罐5-培养基出口 6-喷淋冷却 7-冷却水1234 56736362，连续灭菌设计及计算举例 参见 微生物工程工艺原理P228 伦世仪主编生化工程P22。37373，连续灭菌设备的结构 （，连续灭菌设备的结构 （1）设备结构：）设备结构： 是培养液高温短时间连 续灭菌设备，它与维持 罐组成连续灭菌系统， 分套管式和汽液混合式 两类。是培养液高温短时间连 续灭菌设备，它与维持 罐组成连续灭菌系统， 分套管式和汽液混合式 两类。图2-7 连消塔的构造 培养液蒸汽培养液套管式
14、连消塔套管式连消塔3838 汽液混合式连消塔汽液混合式连消塔图2-8 连消器的构造出料口排液口蒸汽进口进料口3939 维持罐维持罐 ?灭菌系统中的维持 设备，主要是使加 热后的培养基在维 持设备中保温一段 时间，以达到灭菌 的目的，也称保温 设备灭菌系统中的维持 设备，主要是使加 热后的培养基在维 持设备中保温一段 时间，以达到灭菌 的目的，也称保温 设备图2-9 维持罐的外形出料人孔放汽测温口进料4040 喷射加热器喷射加热器 ?可使料液和 蒸汽迅速接 触，充分混 合，加热是 在瞬时内完 成的。可使料液和 蒸汽迅速接 触，充分混 合，加热是 在瞬时内完 成的。4141 薄板换热器4242（2
15、）连消塔计算 参见发酵工程与设备P534343四、连续灭菌与间歇灭菌的比较1，连续灭菌的优缺点 优点 保留较多的营养质量 容易放大 较易自动控制； 糖受蒸汽的影响较少； 缩短灭菌周期； 在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均匀。 缺点 设备比较复杂，投资较大。44442，分批灭菌的优缺点 优点 设备投资较少 染菌的危险性较小 人工操作较方便 对培养基中固体物质含量较多时更为适宜 缺点 灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大 ，一般只限于中小型发酵装置。4545五、影响灭菌的因素 培养基成分对灭菌的影响 油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐 热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削 弱其耐热性。 培养基的物理状态对灭菌的影响 培养基中微生物数量对灭菌的影响 培养基中氢离子浓度对灭菌的影响 培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基 的 酸碱度越大，所需杀灭微生物的温度越低。4646 微生物细胞中水分对灭菌的影响 细胞含水越多，蛋白质变性的温度越底 微生物细胞菌龄对灭菌的影响 老细胞水分含量低、低龄细胞水分含量高 空气排除情况对灭菌的影响 搅拌对灭菌的影响 泡沫对灭菌的影响4747六、发酵罐的灭菌 培养基的灭菌如果是采用连续灭菌法。则发 酵罐应在加入灭
