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1、北方民族大学实验方案果酒酵母的分离、纯化及选育果酒酵母的分离、纯化及选育果酒酵母发酵果酒酵母发酵院(部)名 称：生物科学与工程学院学 生 姓 名：胡菲菲 20092474隆冬玲 20092499马忠孝 20092526张晶 20092475张静艳 20092462专 业:生物工程指导教师姓名:倪志婧2实验三实验三 果酒酵母的分离、纯化及选育果酒酵母的分离、纯化及选育原始数据记录原始数据记录1.筛出 5 株酵母菌2.发酵力试验：采用 CO2失重法不同酵母菌株在发酵过程中 CO2失重的动态变化不同发酵时间（d）下三角瓶的重量/g原重1d2d3d4d5d6dCO2释 放量菌种1164.8163.82
2、161.51159.43158.24157.25155.499.31菌种2152.5151.83150.85149.38148.34147.32145.946.56菌种3158.4156.73154.78152.99152.1151.24150.048.36菌种4155.1153.97152.04150.34149.42148.66147.77.4菌种5156.1155.22152.86151.02149.95149.28148.157.95从上表可以看出 1 号菌株在发酵终了时CO2释放量（g）最多，即 1 号菌株发酵速度最快，是发酵速度较高的酵母。不同发酵时间（d）CO2释放量/g1234
3、56 菌种 10.982.312.081.190.991.76 菌种 20.670.981.471.041.021.38 菌种 31.671.951.790.890.861.2 菌种 41.131.931.70.920.760.96 菌种 50.882.361.841.070.671.133菌种2菌种2菌种1 菌种3菌种4菌种5菌种5菌种500.511.522.501234567 发酵时间失重量从上表可以看出 1 号和 5 号菌株在发酵开始时CO2释放量（g）最快，即 1 号和 5 号菌株发酵力最强。3.耐受性试验做 1 号菌株和 5 号菌株的耐受性试验：采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙
4、醇（5%、6%、7%、8% 、9%）二氧化硫（30、50、60、90、120 mg/L）的耐性。1 号菌株 酒精量（%）56789杜氏小管产气情况充满小 管半管小气泡无气体无气 体 二氧化硫浓度 （mg/L）30506090120杜氏小管产气情况充满小 管充满 小管半管小气泡无气 体5 号菌株 酒精量（%）56789杜氏小管产气情况充满小 管充满小 管半管无气体无气 体 二氧化硫浓度 （mg/L）30506090120杜氏小管产气情况充满小 管充满小 管半管小气泡无气 体从上表可以看出 1 号和 5 号菌株对二氧化硫耐受力基本相同，5 号菌株对酒精耐受力比 14号菌株强。实验方案实验方案果酒是
5、利用新鲜水果为原料，在保存水果原有营养成分的情况下，利用自然发酵或人工添加酵母菌来分解糖分而制造出的具有保健、营养型酒。果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分，还含有丰富的生理活性物质，经常适量饮用具有一定的保健作用。酵母品种是酿造果酒的关键因素之一，酵母性状的好坏直接影响到所酿果酒的口感和风味，决定果酒品质的优劣。果酒酵母包括醇酿酒酵母和非酿酒酵母，前者的应用提高了果酒酿造的生产效率，后者的应用则对果酒的总体风味产生积极的影响。野生型果酒酵母经分离纯化后，结合诱变、杂交、原生质体融合、基因工程及其他育种技术，其酿造性能显著提高，酿造的果酒品质明显改善，因此果酒酵母的选育研究得到了重点关
6、注。本实验选用当季新鲜水果为原料，分离纯化 3-5 株酵母菌，并对其筛选使其适合果酒酿造。一、实验目的和内容一、实验目的和内容 1.学习掌握果酒酵母分离纯化的方法； 2.对分离纯化得到的酵母菌进行筛选使其适合果酒酿造。二、实验原理二、实验原理酿酒酵母细胞透明，呈圆形或椭圆形，形体比较大，一般为 712m，含有转化酶能将葡萄汁中的糖转化成乙醇、二氧化碳和其它代谢产物。优良纯种酵母应具备下列性能：（1）除酿酒水果本身的果香外，酵母也应产生良好的果香与酒香。 （2）生长速度快，有较高的发酵能力，能将糖分全部发酵完。 （3）具有较高的抗S02能力，有较好的凝集力和较快的沉降速度。 （4）培养基成分简单
7、，来源广泛，价格低廉，对温度，pH，离子强度，溶氧等环境因素不敏感。 （5）能在低温或果酒适宜温度下发酵，以保持果香和新鲜清爽的口味。由此可见， 酵母的品质对果酒的产量和质量影响很大。要获得优良的酿酒酵母，必须对其进行分离选育。果酒酵母的筛选应从相应的果品及其种植环境中采样分离，如成熟果实的表皮、自然腐烂发酵的果肉或果汁和果园的土壤等相关场所。根据实践经验，在果汁和自然发酵的果酒醪液中检出率较高，因为它们的基质环境与酿酒环境很相似。为使我们需要的酵母易于检出，应对采集的样品进行富集培养，通过设置较高的酒精浓度、添加SO2 、调整pH 等手段抑制不需要的微生物的生长，使希望检出的微生物得到增殖
8、。酵母检出后，应对其的发酵性能进行考察，包括酵母的一系列生理生化特性和风味物质形成的能力等，这些可通过作生理生化实验和三角瓶小型发酵实验分析和测定。三、实验仪器与材料三、实验仪器与材料样品：苹果YEPD 培养基（富集培养基）: 蛋白胨 20g，葡萄糖 20g，酵母膏 10g，蒸馏水定容至51000ml. PDA 培养基（酿酒酵母培养基） ：马铃薯 200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，蒸馏水定容至 1000ml.（马铃薯去皮，切成块煮沸后再煮 30 分钟，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂溶化后定容至 1000 ml。121灭菌 30 分钟。 ）器具：三角烧瓶(250 mL)、无菌试管、无菌吸管(
9、1 mL 及 5 mL)、无菌滴管、接种环、冰箱、酒精灯、冰箱、玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。四、实验方法与步骤、实验方法与步骤酵母菌在自然界中存在的范围非常广泛，可以从不同的陆地或海洋生物环境中分离得到。在成熟水果的果皮、果梗上存在的酵母种类十分丰富，可针对不同水果原料分离出适合其自身特点的酿酒用酵母菌。(1)酵母菌的分离初筛酵母菌的分离初筛1）菌种采样）菌种采样土壤 样品瓜根际土壤藤下方土壤垄间隙土壤叶片果实（带柄）腐果采集 方法用无菌小铲清去表层石块露出土壤后， 戴好无菌手套取 500g 左右的土样装入无 菌袋内。用无菌剪 刀剪取不 同生长阶 段的
10、叶片 装入无菌 袋内。用无菌剪刀摘 取不同龄期的 甜瓜（幼龄期， 膨大期，成熟 期）分别装入 无菌袋内。用无菌剪 刀摘取腐 烂的果实 装入无菌 袋内。随机选择三块样地采样，每样采三份，将采集到的样品迅速保存在低温箱内(冰块降温)。2）富集培养与）富集培养与纯种分离纯种分离方法一：配制 YEPD 培养基分装于 100ml 三角瓶内每瓶 50ml 高温灭菌冷却，然后分别取适量样品（土样 1g，果皮 5g ，果柄若干，叶片若干）各三份接种，120r/min，28摇床培养 4 天。将富集培养液用接种环划线接种在 PDA 培养基上，每个样品接三个平板，28恒温培养。待菌种长出小菌落，镜检为酵母菌后，将其
11、挑取于 PDA 平板划线并标号后28恒温培养。待再次长出单菌落后，挑取划线于 PDA 培养基上，28恒温培养。菌种划线三到四次后基本纯化。方法二：将腐果装无菌袋置于恒温箱内培养。腐果表面长有白色菌落，镜检为酵母菌后，用接种环将其划线至 PDA 培养基上，28恒温培养。待长出单菌落后，挑取划线于PDA 培养基上，28恒温培养。菌种划线三到四次后基本纯化。(2)酵母菌种的复筛酵母菌种的复筛6选择果酒生产中生产性能优良的新鲜果汁液作为复筛培养基。将初选菌种接入保藏培养基。培养24 h后每支斜面接入三角瓶培养，置于23-25 的培养箱中培养，测定其发酵水平及产香水平，选育出优良健壮、耐性强的适合果酒发
12、酵的酵母菌种。发酵力试验：采用CO2失重法，取100 mL 三角瓶(已经烘干、称重)，各加入80 mL果汁，置于80的水浴杀菌5min，冷却到30后，按每升接种30 mL的比例分别接入酵母种子液，在20 下发酵。发酵过程中每24h 测定1次CO2 损失量，每次测定时，摇晃瓶子，以排出CO2。随着发酵时间的延续，瓶重逐渐减轻， 直到减轻量不高于0.2 g，即表示发酵结束，以CO2失重量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制发酵力曲线，并确定菌株发酵力的强弱。(3)酵母菌的耐受性试验酵母菌的耐受性试验采用杜氏管发酵法测定所筛选的酵母菌对乙醇（8%、10%、12%、14%、16% 、18% 、20% ）
13、、二氧化硫（60、80、100、120、140、160、180、200 mg/L）的耐性。将酵母菌分别接入含不同浓度的乙醇和不同浓度SO2的果汁培养基中，在相同条件下培养，观察杜氏管中气泡产生情况，重复3 次。活化条件：28 条件下，将纯种分离的菌种接种在PDA培养基培养48h发酵条件：28条件下，水果原汁培养基中静止发酵4 d；接种量：1107 cfu/mL。1）耐酒精度试验采用先分别量取无水酒精 8、10、12、14、16ml， 再以水果原汁为培养基， 制成含酒精量为 10%、12%、14%、16% 、18%系列的液体培养基。按下表在试管中加入果汁。然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉
14、塞，115 20min 灭菌。灭菌完后，待试管温度为常温后按下表加入酒精，加完后摇匀。最后在每个编号试管中接入对数期酵母 1107个，28静止培养。观察产气情况，选出耐酒度比较好的菌种。将标签贴于各试管上，标 10、12、14、16、18，按下表每管加入果汁量：试管编号010121416182095%酒精/mL01.051.261.41.681.902.15 果汁/mL108.958.748.608.328.107.85 培养液含酒精%（v/v）01012141618202） 耐SO2试验按亚硫酸含量为 6% 计， 计算出 60、100、120、180、240 mg/L 浓度所需的量，分别加入
15、到果汁中制成 SO 2 不同浓度系列的液体培养基。按下表加入果汁，然后加入杜氏小管倒置使其充满果汁，塞好棉塞，115 20min 灭菌。7灭菌完后，待试管温度常温后按上表加亚硫酸（科密欧试剂 SO2含量6%） ，加完后摇匀。最后在每发酵管中接入对数期酵母 1107个，28静止培养。观察产气情况，选出耐 SO 2比较好的菌种。将标签贴于各试管上，标 1、2、3、4、5，按下表每管加入果汁量：试管编号012345亚硫酸/uL01017203040果汁/mL101010101010培养液含 SO2mg/L060100120180240五、技术指标五、技术指标1富集培养：指从微生物混合群开始，对特定种
16、的数量比例不断增高而引向纯培养的一种培养方法富集培养基：富集培养所采用的培养基为富集培养基富集培养基的作用：使混合微生物中的特定种的数量比例不断增高，并引向纯培养。2.酵母菌镜检：酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见的细菌大几倍甚至几十倍。因此，不必染色即可用显微镜观察其形态。 3. 血球计数板的使用 以计数酵母菌为例 (1)用血球计数板计数酵母菌悬液的酵母菌个数. (2)样品稀释的目的是便于酵母菌悬液的计数,以每小方格内含有 4-5 个酵母细胞为宜, 一般稀释 10 倍即可. (3)将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央计数室上加盖专用的厚玻片. (4)将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的 菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内. (5)计数时,如果使用 16 格25 格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右 下 4 个中格(即 100 个小格)的酵母菌数.如果规格为 25 格16 格的计数板,
