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1、n n 乙酰半胱氨酸对庆大霉素耳蜗损伤的保护作用乙酰半胱氨酸对庆大霉素耳蜗损伤的保护作用n 乙酰半胱氨酸对庆大霉素耳蜗损伤的保护作用本文来源：论文 http:/ 韩敏 张秀秀 李光玲 张秋贵 【摘要】 目的 通过建立大鼠耳毒性损伤模型，观察 n?乙酰半胱氨酸（nac）对庆大霉素所致耳蜗损伤的保护作用。方法 健康wistar 大鼠 60 只，随机分为正常组、对照组、庆大霉素组、nac 干预?1 组、nac 干预?2 组。对照组腹腔注射生理盐水 120 mg/(kg?d),共 14 d；庆大霉素组腹腔注射硫酸庆大霉素 120 mg/(kg?d),共 14 d; nac 干预?1 组在上述剂量腹腔注
2、射庆大霉素前 1 h 腹腔注射 100 g/l 的 nac 350 mg/(kg?d),共 14 d; nac 干预?2 组注射庆大霉素(同庆大霉素组)14 d 后再腹腔注射 nac 3 350 mg/(kg?d),共 14 d。所有动物在实验前作听性脑干反应（abr）阈值测定,除正常组外其他组动物分别在全部用药结束后 24 h 作 abr 阈值测定，处死后取听泡，苏木精?伊红染色法观察耳蜗各部的组织学改变；免疫组织化学法检测耳蜗中核因子?b （nf?b）及肿瘤坏死因子? （tnf?）的表达。结果 用药结束后，庆大霉素组 abr 阈值与其他组比较差异均有显著性（f=74.77，q=3.285.
3、29,p0.05） ，nac干预?2 组与其他组比较差异均有显著性（q=2.243.28,p0.05） 。庆大霉素组和 nac 干预?2 组血管纹、螺旋神经节和 corti 器毛细胞 nf?b、tnf? 表达增强，与其他组比较差异均有显著性（f=27.4748.81，q=1.344.31,p0.05） 。结论 nf?b 和tnf? 可能共同参与了耳蜗药物性损伤过程，nac 可能对庆大霉素所致的耳蜗损伤具有保护作用。 【关键词】 耳蜗;庆大霉素；药物毒性；n?乙酰半胱氨酸；大鼠,wistar abstract objective to investigate the protection of
4、n?acetylcysteine (nac) against the damage of cochlea caused by gentamicin by creating a rat model of ototoxicity. methods sixty healthy wistar rats were randomized to five groups: the normal, control, gentamicin ototoxicity (go), nac intervention?1 (naci?1) and nac intervention?2 (naci?2) groups. to
5、 the control, peritoneal injection (pi) of normal saline 120 mg/(kg?d) was given; to the go, pi of gentamicin 120 mg/(kg?d) was offered; to the naci?1, pi of nac 350 mg/(kg?d) was done one hour before pi of the same dosage of gentamicin was gi?ven as the former two groups. the course was 14 days for
6、 the above three groups. to the naci?2, 14 days after pi of gentamicin, same as the go, and then pi of nac 350 mg/(kg?d) was carried out for another 14 days. all the rats underwent abr leak?point detection before experiment and 24 hours after ending of medication, except those in the normal group. t
7、he rats were killed and the otic vesicles collected, which were stained with hematoxylin?eosin, the histomorphology of cochlea was observed. the expression of nf?b and tnf? was studied immunohistochemically. results upon completion of medication, the difference of abr between the go and the other fo
8、ur groups (f=74.77;q=3.28-5.29;p0.05), and that of abr between the naci?2 and the other four groups were significant (q=2.24-3.28,p0.05). the expression of nf?b and tnf? in psalterial cord, spiral ganglion and corti hair cell in the go and naci?2 was stronger than that in the other four groups (f=27
9、.47-48.81;q=1.34-4.31;p0.05). conclusion nf?b and tnf? may involve in the course of pharmacologic damage of the cochlea caused by gentamycin, on which nac probably shows its protection. key words cochlea; gentamicin; drug toxicity; n?acetylcysteine; rat, wistar 耳毒性药物损伤是当前临床治疗的一大难题，众多学者围绕其发病机制及治疗展开了深
10、入的研究，以期为临床治疗耳毒性药物损伤提供更好的思路和方法。 关于药物性损伤的机制，目前多认为与自由基损伤、钙离子超载等有关 1?2，但其损伤机制尚不明确。 近年来，药物性损伤中核因子?b （nf?b）和肿瘤坏死因子?（tnf?）所起作用引起人们的广泛关注。本研究在建立耳蜗耳毒性药物损伤动物模型的基础上，通过检测 n?乙酰半胱氨酸（nac）干预下耳蜗组织形态学及 nf?b 和 tnf? 表达的变化，以期探讨 nac 对庆大霉素耳蜗损伤的保护作用。现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 材料来源 选用耳廓反射灵敏的健康 wistar 大鼠 60 只，雌雄不拘，体质量 150200 g。nac
11、 粉剂由北京拜尔迪生物有限公司提供，鼠抗鼠nf?b 及兔抗鼠 tnf? 单克隆抗体分别由北京中杉生物有限公司和武汉博士德生物有限公司提供。 1.2 分组及处理 将健康 wistar 大鼠随机分为正常组、对照组、庆大霉素组、nac 干预?1 组、nac 干预?2 组，各 12 只。对照组腹腔注射生理盐水120 mg/(kg?d),共 14 d。庆大霉素组腹腔注射硫酸庆大霉素 120 mg/(kg?d),共 14 d; nac 干预?1 组上述剂量腹腔注射庆大霉素前 1 h 注射 100 g/l 的 nac 350 mg/(kg?d),共 14 d; nac 干预?2 组注射庆大霉素(同庆大霉素组
12、) 14 d 后再腹腔注射 nac 3 350 mg/(kg? d),共 14 d。 1.3 听性脑干反应(abr)测试 动物在实验前及用药结束后 24 h 行 abr 阈值测定。动物经腹腔注射体积分数 0.10 的水合氯醛(150 mg/kg)麻醉， 测试采用nicoletspirit 诱发电位仪，记录电极置颅顶硬膜下,参考电极置同侧耳廓,对侧耳廓接地。耳机紧贴刺激耳，声刺激选短音(升降时间各为 1 ms),刺激频率为 8、4、2、1 khz。带通滤波 1501 500 hz。记录双耳 abr 之波反应阈值。 1.4 免疫组织化学染色及观察 停药并测试完 abr 后迅速处死大鼠，断头后取出听
13、泡，剪开听泡暴露耳蜗，浸入 25 g/l 的戊二醛固定液中。在解剖显微镜下开放卵圆窗和圆窗,在蜗顶钻孔缓慢注入 25 g/l 的戊二醛固定液,将标本于 4 下置于固定液中固定 24 h 以上,经 pbs 冲洗后放入 edta 中进行脱钙，每隔 1 d 换液 1 次，约 10 d 后脱钙完成，按石蜡标本制作程序制作切片，片厚 6 m，行免疫组织化学染色。 组织切片常规脱腊至水，tnf? 组无需热修复，nf?b 组需热修复；常温下正常血清封闭 20 min，甩干后加一抗（nf?b 150， tnf? 150） ，常温下放置 2 h，滴加生物素化二抗液，室温孵育 20 min。苏木精复染，显微镜下观
14、察。 1.5 结果判断 光镜下 tnf? 及 nf?b 表达阳性的细胞呈棕黄色，阴性对照不着色。 1.6 nf?b 和 tnf? 平均灰度值的测定 采用 moticimage advance 图像分析仪，分别测量各组大鼠耳蜗组织不同部位 nf?b 和 tnf? 平均灰度值。 1.7 统计学分析 实验数据以s 表示,采用 spss 11.0 及 ppms 1.53 统计软件进行统计学分析,多个样本均数差异的显著性检验应用方差分析。 2 结果 2.1 abr 测试 正常组 abr 阈值和对照组用药后比较差异无显著性（p0.05） ；用药后庆大霉素组 abr 阈值与其他组比较差异均有显著性（f=74
15、.77，q=3.285.29,p0.05） ；nac 干预?2 组 abr阈值与其他组比较差异均有显著意义（q=2.243.28,p0.05） 。见表 1。表 1 各组 abr 测试结果（略） 2.2 组织学观察 正常组、对照组大鼠耳蜗 corti 器毛细胞无损伤，血管纹清晰。庆大霉素组、nac 干预?1、2 组大鼠耳蜗 corti 器毛细胞变形，崩解破坏，散在缺失，螺旋神经节神经元数目减少，血管纹变薄，其中以庆大霉素组损伤最严重；nac 干预?1 组毛细胞轻微损伤，血管纹尚清晰；nac 干预?2 组见毛细胞变形、破坏、血管纹变薄。 2.3 各组大鼠耳蜗各部位 nf?b 和 tnf? 表达 正
16、常组血管纹、螺旋神经节、corti 器 nf?b、tnf? 表达与对照组比较，差异无显著意义（p0.05） ；庆大霉素组和 nac 干预?2 组血管纹、螺旋神经节和 corti 器 nf?b、tnf? 表达与其他组比较差异均有显著性（f=27.4748.81，q=1.344.31,p0.05） ；nac 干预?1 组与正常组和对照组比较差异无显著性（p0.05） 。见表 2、3。表 2 各组大鼠耳蜗各部位 nf?b 表达灰度值及其比较、 表 3 各组大鼠耳蜗各部位 tnf? 表达灰度值及其比较（略） 。 3 讨论 在长期应用氨基糖甙类抗生素（aman）的治疗过程中,耳毒性发生率可高达 80%。aman 的耳毒性靶细胞主要是耳蜗和前庭毛细胞,其损伤可引起不可逆的听力丧失和前庭功能障碍。本实验结果显示，庆大霉素组的 abr 阈值与正常组比较有显著性差异。 nf?b 主要分布在螺
