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1、细胞转染实验原理、仪器试剂和操作步骤细胞转染实验原理、仪器试剂和操作步骤外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。关键词：关键词：细胞转染脂质体转染法电击法磷酸钙法病毒介导法1实验目的实验目
2、的学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法，观测外源蛋白的表达（绿色荧光蛋白），为染色准备实验材料。2实验原理实验原理上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且
3、可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。本次实验采用的脂质体是 promega 公司的 TransFast 脂质体试剂，它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物，是对于本次实验中采用的 293T 细胞优化的转染试剂。3. 实验材料与器材实验材料与器材1）材料）材料293T 细胞MyoD 表达质粒和 EGFP
4、 表达质粒DMEM 培养基链霉素/青霉素（双抗）FCS（小牛血清）PBS（磷酸盐缓冲溶液）胰酶/EDTA 消化液转染试剂（TransFast）易生物试剂库：http:/ 微量移液器和 Tip 头酒精灯废液缸血球计数板涡旋振荡器恒温水浴箱台式离心机35mm 培养皿转染管15ml 离心管观察用倒置显微镜荧光显微镜和 CCD易生物仪器库：http:/ 实验步骤实验步骤细胞传代细胞传代(1) 试验准备：200ul/1mlTip 头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。(2) 弃掉培养皿中的培养基，用 1ml 的 PBS 溶液洗涤两次。(3) 用
5、Tip 头加入 1ml Trypsin 液，消化 1 分钟（37。C，5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。(4) 加入 1ml 的含血清培养基终止反应。(5) 用 Tip 头多次吹吸，使细胞完全分散开。(6) 将培养液装入离心管中，1000rpm 离心 5min。(7) 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择 0.8X106个细胞加入一个 35mm 培养皿。(8) 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。(9) 将培养皿转入 CO2培养箱中培养，第二天转染。细胞转染细胞转染1）转染试剂的准备A. 将 400ul 去核酸酶水加入管中，
6、震荡 10 秒钟，溶解脂状物。B.震荡后将试剂放在20 摄氏度保存，使用前还需震荡，。2） 选择合适的混合比例（1：11：2/脂质体体积：DNA 质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的 MyoD 或者 EGFP 的 DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。5） 将混合液在室温放置 1015 分钟。6) 吸去培养板中的培养基，用 PBS 或者无血清培养基清洗一次。7） 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。8） 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养 2448 小时。第二次细胞传代第二次细胞传代1） 在转染后 24
7、小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。2） 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度 0.8X105个细胞/35mm 培养皿将细胞重新粉入培养皿中。3） 在正常条件下培养 24 小时后按照染色要求条件固定。转染条件优化可以参考 TransFast 的使用说明书。磷酸钙细胞转染技术磷酸钙细胞转染技术磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA 复合物的一种将 DNA 导入真核细胞的转染方法，磷酸钙被认为有利于促进外源 DNA 与靶细胞表面的结合。实验目的实验目的 1 了解细胞转染技术原理和基本方法 2 磷酸钙沉淀法的基本技术要点 实验原理实验原理 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA 复合物的一种将 D
8、NA 导入真核细胞的转染方法，磷酸钙被认为有利于促进外源 DNA 与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA 复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的 DNA 可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。这种方法首先由 Graham 和 van der Ebb 使用，后由 Wigler修改而成。可广泛用于转染许多不同类型的细胞，不但适用于短暂表达，也可生成稳定的转化产物。 仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂 1 呈指数生长的真核细胞（如 HeLa,BALB/c 3T3,NIH 3T3,CHO,或鼠胚胎成纤维细胞） 2 完全培养液（依所用的细胞系而定） 3 CsCl 纯化的
9、质粒 DNA （1050g/次转染，二次纯化） 4 2HEPES 缓冲盐水(HeBS) (pH6.957.05) 50.0mmol/L HePes;280mmol/L NaCl;10mmol/L KCl;1.5mmol/L 葡萄糖。用 0.5mmol/L NaOH 调 pH 至 6.957.05,过滤除菌后,-20保存备用。 5 2.5mol/L CaCl2 过滤除菌,-20保存备用。 6 磷酸缓冲盐水（PBS） 7 37，5%CO2 的加湿培养箱 8 100mm 组织培养平板 9 15ml 锥形管 方法与步骤方法与步骤 1 传代细胞准备 细胞在转染前 24传代,待细胞密度达 50%60%满底
10、时即可进行转染。加入沉淀前 34h，用 9ml 完全培养液培养细胞。 2 DNA 沉淀液的准备 首先将质粒 DNA 用乙醇沉淀（1050g/10cm 平板），空气中晾干沉淀，将 DNA 沉淀重悬于 L 无菌水中，加 50L2.5mol/L CaCl2。 3 用巴斯德吸管在 500L 2HeBS 中逐滴加入 DNA-CaCl2 溶液，同时用另一吸管吹打溶液，直至 DNA-CaCl2 溶液滴完，整个过程需缓慢进行，至少需持续 12min。 4 室温静置 30min,出现细小颗粒沉淀。 5 将沉淀逐滴均匀加入 10cm 平板中，轻轻晃动。 6 在标准生长条件下培养细胞 416h。除去培养液，用 5m
11、l 1HeBS 洗细胞 2 次，加入 10ml 完全培养液培养细胞。 7 收集细胞或分入培养皿中选择培养。 注意事项 1 在整个转染过程中都应无菌操作。 2 为获得最佳实验结果，DNA 应不含蛋白质和酚。乙醇沉淀后的 DNA 应保持无菌，并在无菌水或 Tris EDTA 中溶解。 3 沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在磷酸盐溶液中加入 DNA-CaCl2 溶液时需用空气吹打，以确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的 DNA 不能有效地粘附和进入细胞。 4 在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个 pH 都可能导致磷酸钙转染的失败。磷酸钙磷酸
12、钙-DNA 共沉淀法（贴壁细胞转染）共沉淀法（贴壁细胞转染）此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。关键词：关键词：磷酸钙细胞 DNA 共沉淀法贴壁细胞转染细胞转染核酸以磷酸钙-DNA 共沉淀物的形成出现时，可使 DNA 黏附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的 DNA 仅有 1%-5%可以进入细胞核中，其中仅有不到 1%的 DNA 可以与细胞 DNA 整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为 10-4，这项技术能用于任何 DNA 导入哺乳动物细胞进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。 1、配液：
13、、配液： 2 HBS1.63gNaCl；1.19g Hepes；0.023gNa2PO4.2H2O；加水至 100ml（pH7.1），过滤，4保存。 2mmol/L CaCl2过滤除菌。 TE 0.1mmol/L EDTA；1mmol/L Tris-HCl(pH 8.0). G418（新霉素 G418）液 1g G418 溶于 1mmol/L Hepes 缓冲液中，加水至 10ml，过滤除菌，4保存。 G418 选择性培养基用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基配制，G418 浓度为 200-800mg/L。 注意对受体细胞先做预实验，选用在 10-14 天内能杀死细胞 50%以上的最低浓度
14、。 2、操作步骤（方法一）：、操作步骤（方法一）： （1）供体 DNA 制备：按前介绍的 DNA 提取法提取 DNA，溶于 TE 中，40mg/L。 (2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类 Alu 序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠 NIH-3T3 细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前 1 天接种细胞，接种密度为 2104个/cm2，用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基，37、5% CO2培养，待细胞占 50%-70%瓶底面积时，用于转染试验。 (3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备： 将供体细胞 DNA 和 PSV-2neo 质粒载体 DNA 用 TE 配制成 40m
15、g/L 的 DNA 溶液，同时想供体细胞 DNA 溶液 200ul 中加入新霉素基因的质粒 DNA 溶液（20mg/L）220ul 和 2 x HBS 250ul（PSV2-neo 为 1-2mg/L）。 取 500ul 上述 DNA 溶液加入硅化试管中，缓慢加入 3.1ml CaCl2(2mol/L)混匀 30s。 然后立即混旋，室温下静置 30min，待溶液轻度浑浊后，吹打后即用于转染受体细胞。 (4)转染受体细胞： 将处于对数生长期已占瓶底 50%-70%的受体细胞在转染前 4h 更换一次新鲜培养基，每瓶5ml（25ml 培养瓶）。 吸取 0.5DNA-磷酸钙沉淀，加入含 5ml 培养基
16、的细胞瓶中摇匀。 置 37、5% CO2培养 24h 或更长，使细胞充分吸入 DNA-磷酸钙结晶颗粒。 更换新鲜培养基，继续培养 24h，诱导转染基因的表达。 更换浓度为 800mg/L 的 G418 选择培养基进行筛选。同时设有未能转染的对照细胞。 培养大约 3-5 天，对照细胞大部分死亡，这时转染细胞更换浓度为 200mg/L 的 G418 选择培养基，每 3-4 天更换一次选择培养基。 2 周后对照细胞死亡，在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现，待其增大后再进行克隆化和扩大培养。可建立转化细胞株，并作进一步鉴定。 本实验要加入 PSV-neo、DNA 于外源 DNA 共转染受体细胞，这样可使受体细胞获得新霉素（neo）基因的抗药性，这样即使癌基因没有出现明显的“转化灶”，也可测出转入的
