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1、 1 / 16第第 3 课时课时 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数目标导读 1.了解尿素的作用原理及能被细菌分解的原因。2.理解并掌握筛选菌落和统计菌落数目的方法及对照实验的设计方法。3.掌握土壤微生物的取样、稀释、培养和观察。4.掌握尿素分解菌的鉴定方法。重难点击 1.研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。2.能利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数问题。一 筛选微生物的研究思路要把某种微生物和其他的微生物分开，就要利用其代谢特点设计合适的培养基。1.筛选菌株(1)实例：DNA 多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少
2、量 DNA 大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温(93 左右)的 DNA 聚合酶。1966 年美国微生物学家布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了水生耐热细菌 Taq，从该细菌中分离得到了耐高温的 TaqDNA 聚合酶。(2)原因：因为热泉温度 7080 淘汰了绝大多数微生物，而使耐热的 Taq 细菌被筛选出来。(3)启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。(4)实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。2 / 16(5)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或
3、阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。(6)下面是本课题使用的培养基的配方，请分析：KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO47H2O0.2 g葡萄糖10.0 g尿素1.0 g琼脂15.0 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到 1 000 mL从物理性质看此培养基属于固体培养基，是由于加入了凝固剂琼脂。从功能上看属于选择培养基，此培养基的氮源只有尿素，能利用尿素的微生物可分泌脲酶，因此能在此培养基上生长，此培养基属于选择培养基。2.统计菌落数目常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法稀释涂布平板法。(1)统计菌落数目稀释：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个
4、菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。计数：一般选择菌落数在 30300 的平板进行计数。统计：通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为使结果接近真实值，可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。(2)活菌数的计算方法：每克样品中的菌株数 (某一稀释度下平板上生长的平均菌落数涂布平板时所用的稀释液的体积)稀释倍数。(3)统计菌落数目：关键是恰当的稀释度。一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数3 / 16在 50 个左右为最好。(4)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此
5、，统计结果一般用菌落数来表示。小贴士 显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。1原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积 1 mm2和高 0.1 mm 的计数室，在 1 mm2的面积里又被划分成 25 个或 16个中格，每个中格进一步划分成 16 个或 25 个小格，计数室由 400 个小格组成。2操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数 45 个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。3计数公式：每毫升原
6、液所含细菌数每小格平均细菌数40010 000稀释倍数。4缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。3.设置对照 (1)教材中两位同学的统计结果中，第二位同学的结果接近真实值。实验需要改进的操作是第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。(2)设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。设置对照的方法：空白对照：不给对照组任何处理因素；条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素；自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行；相互
7、对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。(3)教材提供的案例中 A 同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。如何设置对照实验来确定原因？答案 方案一：其他同学用与 A 同学一样的土样进行实验，如果结果与 A 同学一致，则证明 A 同学操作无误；如果结果不同，则证明 A 同学存在操作失误或培养基的配制有问题。方案二：将 A 同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。4 / 16通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照实验的设置是必不可少的。归纳提炼1.选择培养基(1)选择培养基的含义：在培养基
8、中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离出所需要的微生物。(2)常见的选择培养基加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。无氮源培养基可以分离固氮微生物。石油是唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。 将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。2.用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项(1)为了保证结果准确，一般设置 35 个平板，选择菌落数在 30300 的平板进行计数，并取其平均值。(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
9、。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。1.在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入 10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出( )A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌 B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌C.固氮细菌、霉菌、放线菌 D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌问题导析 缺乏氮源的培养基，只有固氮菌能够生长；加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌都是细菌，不能生长；培养基中加入 10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长，放线菌能够生长。解析 固氮细菌可以在无
10、氮培养基上生长；青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，但不会抑制霉菌的生长；加入 10%的酚的培养基可以抑制细菌和霉菌的生长，但不会抑制放线菌的生长。5 / 162.用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是( )A.菌落数量最多的平板 B.菌落数量最少的平板C.菌落数量适中的平板 D.取若干个平板菌落数量的平均值问题导析 (1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30300 的平板进行计数。(2)为使结果接近真实值，需取多个平板培养计算出菌落平均数。解析 用稀释涂布平板法对样品中活菌数目进行统计，只是一种估测，根
11、据此方法的实验过程可知，在某一稀释度下涂布的平板菌体数具有一定的偶然性，并不是绝对均匀，所以取若干个平板菌落数量的平均值比较接近样品中菌株数的真实值。二 实验设计与操作下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析：1.实验设计和操作提示步骤实验操作操作提示土壤取样从酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样。先铲去表层土 3 cm 左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中取样用的小铁铲和盛土样的信封都要经过灭菌；土壤中的微生物主要分布在距地表 38 cm 的近中性土壤中，约70%90%为细菌6 / 16制备培养基分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和尿素为唯一氮源的选择培养基牛肉膏
12、蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用样品的稀释和涂布称取 10 g 土样加到盛有 90 mL 无菌水的锥形瓶中，充分摇匀；吸取上清液 1 mL，转移至盛有 9 mL 的生理盐水的无菌大试管中，按照上图流程进行样品的稀释；按照由 107103稀释度的顺序分别吸取 0.1 mL 进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管应在火焰旁称取土样；由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围 103107倍的稀释液；实验时要对所用的平板、试管作好标记。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等培养将涂布好的培养皿放在 3037
13、 温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，才说明选择培养基有选择作用计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在30300 的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对 3 个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目如果得到了 2 个或 2 个以上菌落数目符合要求的平板，则说明稀释操作比较成功；如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不精确，需要重新实验；在菌落计数时，每隔 24 h 统计一次菌落数目。选取菌落数目稳
14、定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目2.讨论7 / 16(1)为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？答案 原因：土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的，因此为获得不同类型的微生物就需要按不同的稀释度进行分离。稀释度微生物细菌放线菌真菌稀释度104、105、106103、104、105102、103、104目的：保证获得菌落数在 30300 的平板进行计数。(2)不同的微生物培养的温度和时间相同吗？答案 培养不同微生物往往需要不同培养温度和培养时间。微生物细菌放线菌霉菌培养温度3037 2528 2528 培养天数12 d57 d34 d3.菌落特征：包括菌
15、落的形状、大小、隆起程度和颜色等。4.菌种的鉴定挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，由于细菌合成的脲酶分解尿素产生了氨，使培养基的碱性增强，pH 上升，使指示剂变色，菌落周围变红。归纳提炼分离尿素分解菌操作中的注意事项(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有 30300 个菌落，这个稀释度细菌一般为104、105、106倍液，放线菌一般为 103、104、105倍液，真菌一般为 102、103、104倍液。8 / 16(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置空白牛肉膏蛋白胨培养基进行
16、对照。(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布 3 个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板重新制作。1.下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是( )A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板B.取 104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各 0.1 mL，分别涂布于各组平板上C.将实验组和对照组平板倒置，37 恒温培养 2448 小时D.确定对照组无菌后，选择菌落数在 300 以上的实验组平板进行计数问题导析 (1)设置不同稀释度的土壤稀释液，可以对照说明稀释倍数对细菌计数的影响。(2)对细菌进行计数时，制作的平板大小为每个平板上生长有 30300 个菌落。解析 检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，A项正确；取 104、105、106倍的土壤稀释液
