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1、CD4+CD25+调节性T细胞在肝移植术后腹腔感染中的表达及其作用【摘要】 目的 研究移植后细菌感染CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)表达的变化。方法 以DA大鼠为供体，LEW大鼠为受体，采用改良的Kamada二袖套法建立肝 移植模型。术后随机分为3组，G1组术后3 d腹腔生理盐水注射；G2组术后3 d给予腹腔大肠杆菌注射；G3组术后常规给予免疫抑制药物CsA，3 mg/(kgd)。感染后7 d处死动物，每组6个样本，检测血清ALT、TB，并采用流式细胞术检测脾 脏Treg的水平，RTPCR方法检测脾脏Foxp3和肝脏IL10、TGF mRNA的表达。结果 G3、G2组Treg表达水平
2、显著升高，分别为：(16.720.95)%，(27.4 1.09)%，与G1(9.880.98)%比较差异均有统计学意义(P0.01)；脾 脏Foxp3和肝脏IL10、TGF mRNA表达水平均增加；感染组的肝功虽然较差，与排斥组相比无统计学 意义，但从病理切片观察该组肝脏的急性免疫排斥反应减轻，Banff评分 有统计学意义。结论 大鼠肝移植术后腹腔细菌感染增加了脾脏Treg的表达，促进了免疫抑制 作用的发挥，部分减轻了急性排斥反应。 【关键词】 肝移植； 腹腔感染； CD4+CD25+调节性T细胞； 急性排斥反应【Abstract】 Objective To investigate expr
3、ession of CD4+CD25+ regulatory T cells in model of abdominal cavity bacterial infection after liver transplantation in rats. Methods Orthotopic liver transplant (OLT, DA to Lewis) models were established by modified Kamada twocuff technique. All rats were randomly divided into 3 groups after operati
4、on. Normal saline was injected into abdominal cavity at 3rd day postoperatively in group 1, mixed Bacillus coli liquid in group 2 and CsA at 3 mg/kg per day in group 3. Six recipients were sacrificed 7 days after infection in each group, blood and graft samples were collected for detection of ALT an
5、d TB. The levels of Treg and Foxp3 in spleens and IL10, TGF mRNA in livers were detected by flow cytometry and RTPCR, respectively. Results Compared with the level of Treg for 9.880.98 in group 1, the levels of Treg increased obviously in groups 2 and 3 (16.720.95 vs 27.41.09), with statistical diff
6、erence (P0.01), so do the expressions of Foxp3, IL10 and TGF mRNA. Although the serum concentrations of AST and TB 7 d in Group 2 was higher than those in Group 1, the Banff scores of grafts in group 2 were lower than those in group 1 (P0.05). Conclusions Abdominal cavity bacterial infection after l
7、iver transplantation in rats increase expression of Treg, promote the immunosuppressive action and partially alleviate the acute rejection.【Key words】 Liver transplantation; Abdominal cavity bacterial infection; CD4+CD25+ regulatory T cells; Acute rejection肝移植已成为终末期肝病及急性肝功能衰竭的有效治疗方法，然而术后创 伤及大量激素和免疫抑
8、制药物的应用又会增加细菌、病毒、真菌的感染， 这也是肝移植术后引起死亡的常见原因之一1- 2。在重症感染时机体的免疫系统在经历免疫激活后会进入免疫抑制状 态，以防止组织器官的过度病理损害， 其中CD4+CD25+免疫抑制性细胞发挥了重要作用3。移植后由于创伤 及免疫抑制药物的应用，机体处于免疫受损状态，此时合并细菌感染的机 体免疫状态会发生怎样的变化，CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)表达水 平如何，对肝功及免疫排斥会有怎样的影响?本研究旨在探明上述问题。1 材料与方法1.1 材料成年雄性近交系DA大鼠(体质量200 g左右)为供体，购于哈尔滨医科大学动物中心。以成年雄性近交系Lewi
9、s 大鼠(体质量200220 g)为受体，购于北京维通利华实验动物有限公司。适应性饲养于西南医院 肝胆科实验中心动物室。供受体术前12 h禁食，不禁水，术后自主食水。主要试剂：流式单克隆抗体购自Bioleg end公司，包括PE antirat CD4(W3/25，IgG1)；FITC antirat CD25(OX39，IgG1)，EZSepTM Mouse IX淋巴细胞分离液购自达科为生物技术有限公司；TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver 3.0试剂盒购自宝生物工程有限公司。1.2 方法1.2.1 动物模型的建立：本实验采用改良的Kamada二袖套法4，无需静脉分 流，建
10、立大鼠肝移植模型。随机分为(1)免疫排斥组(G1)：大鼠肝移植术 后3 d腹腔内生理盐水注射；(2)移植术后感染组(G2)：于移植术后3 d腹腔内大肠杆菌注射，注射量为5105 CFU/ml；(3)免疫抑制组(G3)：移植术后CsA肌注，注射量3 mg/(kgd)。感染后7 d每组随机处死动物6只，取血及肝脏、脾脏，备相应指标及病理学检测。1.2.2 检测指标及实验方法(1)脾脏CD4+CD25+细胞亚群检测：处死大鼠，无菌取脾，用EZSepTM Mouse IX淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1106/ ml。取上述淋巴细胞混悬液50 l，加入标有荧光素的单克隆抗体工作
11、液50 l(每种抗体各25 l)；37 水浴30 min，避光；加入PBS 10 m1，混匀；1 000 r/min离心10 min；重复离心1次；加入1 ml PBS缓冲液混匀；上机检测。(2)脾脏Foxp3 mRNA的表达：用Trizol液提取100 mg脾组织mRNA，分光光度法测定RNA的纯度，采用RTPCR技术，以G3P DH为内参，引物序列Foxp3：Sense 5CCCAGGAAAGACAGCAACCTT3，Antisense 5CTGCTTGGCAGTGCTTGAGAA3，扩增产物片段长度为619 bp；G3PDH：Sense 5GCATGGCCTTCCGTGTTCCTAC3，
12、Antisense 5ACTCCTTGGAGGCCATGTAGGC3，扩增产物片段长度为318 bp。PCR反应参数：预变性94 5 min，PCR反应94 30 s、57 30 s、72 1 min，35个循环，延伸72 10 min。用凝胶成像系统照相，Bandscan软件进行图像分析，结果以目的 区带的光密度值积分/内参区带的光密度值积分表示，作为目的mRNA的相 对含量，进行半定量分析。(3)肝脏内IL10、TGF mRNA的表达：RNA提取同上述，仍以G3PDH为内参。引物序列IL10：S ense 5GCTGACAGATTCCTTACTGCAGG3，Antisense 5ACGTA
13、GGCTTCTATGCAGTTGATG3，片段长度为321 bp；TGF： Sense 5CACCTGCACAGCTCCAGGCAC3，Antisense 5CTTGCGACCCACGTAGTAGACG3，片段长度312 bp，反应条件：退火温度分别为61、62 。PCR产物在1.5%的琼脂凝胶上电泳，用BandScan软件计算扩增条带 灰度值。(4)血清ALT、TB表达水平：经腹主动脉取血2 ml，分离血清，用Beckman全自动生化分析仪检测血中谷氨酸氨基转移 酶(ALT)和总胆红素(TB)的水平。1.3 统计学分析统计用SAS软件计算，组间比较采用t检验，各组病理学急性排斥反应Ban f
14、f评分的比较采用秩和检验。2 结果2.1 脾脏Treg的增殖变化各组的Treg均有不同程度的表达，G1=(9.880.98)%，G2=(27.41. 09)%，G3=(16.720.95)%，各组间比较差异均有统计学意义(P0.0 1，G2与G1、G3相比P值分别为0.000 0和0.000 3)。2.2 脾脏Foxp3 mRNA的表达各组脾脏内Foxp3 mRNA水平均有不同程度的表达，G1：(0.5590.06)%，G2：(0.963 0.11)%，G3：(0.7810.09)%，G2与G1组相比差异有统计学意义(P= 0.001 10.01)；与G3相比差异有统计学意义(P=0.0310
15、.05)，见图1。13：G1G3图1 脾内Foxp3 mRNA的表达水平2.3 肝脏内IL10、TGF mRNA的表达各组IL10和TGF mRNA水平均有不同程度的表达，IL10的水平在G2表达水平最高，与G1 、G3相比差异均有统计学意义，而TGFmRNA的水平在G3组表达最为显 著，G2次之，各组间比较差异仍有统计学意义，见表1、图2、3。 表1 各组肝内IL10和TGF的表达水平2.4 肝功能检查 G3组大鼠肝移植术后ALT、TB有轻度增高，G1、G2组两种指标显著升高 ，两组相比差异无统计学意义，与G3相比差异有统计意义(P=0.000 0)。见表2。表2 各组肝功能变化比较2.5 肝脏病理改变移植感染后可见汇管区有淋巴细胞浸润，肝小叶结构不清，中央静脉扩张 ，充血，仅有少量淋巴细胞浸润，与免疫抑制组表现相似，但肝细胞破坏 更明显；和免疫排斥组相比，后者汇管区和中央静脉大量淋巴细胞浸润， 累及周围肝实质，胆管炎症明显，胆管细胞模糊、胞质空泡形成，极性紊 乱，甚至消失(图49)。各组病理学Banff评分5见表3。表3 各组移植后7 d的移植物病理切片的排斥反应Banff评分的比较图4 移植感染后可见汇管区淋巴细胞浸润，胆管细胞空泡，排列较整齐 (HE 200) 图5 移植后感染后可见中央静脉
