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1、一些试剂的生化作用原理一些试剂的生化作用原理1溶液 I溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 -1,4 糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中 pH 小于 8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA 受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合 Mg2、Ca2等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对 DNA 的降解作用（DNase 作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA 的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。2溶液 IINaOHSDS 液：NaOH：核酸在 pH 大于 5，小于 9 的溶液中，是
2、稳定的。但当 pH12或 pH3 时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液 II 中的NaOH 浓度为 0.2mo1L，加抽提液时，该系统的 pH 就高达 12.6，因而促使染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性。SDS：SDS 是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。 （2）解聚细胞中的核蛋白。 （3）SDS 能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-R-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是 SDS 能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用 RNase 去除 RNA 时）受到干扰。3.
3、 溶液 III-3molL NaAc（pH4.8）溶液：NaAc 的水溶液呈碱性，为了调节 pH 至 4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是 NaAc-HAc 的缓冲液。用 pH4.8 的 NaAc 溶液是为了把 pH12.6 的抽提液，调回 pH 至中性，使变性的质粒 DNA 能够复性，并能稳定存在。而高盐的 3molL NaAc 有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA 以及 SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。4为什么用无水乙醇沉淀 DNA？用无水乙醇
4、沉淀 DNA，这是实验中最常用的沉淀 DNA 的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA 溶液是 DNA 以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA 周围的水分子，使 DNA 失水而易于聚合。一般实验中，是加 2倍体积的无水乙醇与 DNA 相混合，其乙醇的最终含量占 67左右。因而也可改用 95乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比 95乙醇昂贵） 。但是加 95的乙醇使总体积增大，而 DNA 在溶液中有一定程度的溶解，因而 DNA 损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀
5、DNA 时可用 95乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用 0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀 DNA。一般在室温下放置 1530 分钟即可。5在用乙醇沉淀 DNA 时，为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达 0.10.25mol/L？在 pH 为 8 左右的溶液中，DNA 分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc 或 NaCl，使 Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分 DNA 形成 DNA 钠盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高
6、时，其效果也不好。在沉淀的 DNA 中，由于过多的盐杂质存在，影响 DNA 的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。6加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用 SDS 与 KAc 来处理？加进去的 RNase 本身是一种蛋白质，为了纯化 DNA，又必须去除之，加 SDS 可使它们成为 SDS-蛋白复合物沉淀，再加 KAc 使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的 SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除 RNase。在溶液中，有人以 KAc 代替 NaAc，也可以收到较好效果。7为什么在保存或抽提 DNA 过程中，一般采用 TE 缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲
7、液的主要原则是考虑 DNA 的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作 DNA 的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2产生 Ca3(PO4)2 沉淀；在 DNA 反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用 Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存 DNA 时，大都采用 Tris-HCl 系统，而 TE 缓冲液中的 EDTA 更能稳定 DNA 的
8、活性。8如何选择聚乙二醇（6000）的浓度来沉淀 DNA？采用 PEG（6000）沉淀 DNA，大小不同的 DNA 分子所用的 PEG 的浓度也不同，PEG 的浓度低，选择性沉淀 DNA 分子量大，大分子所需 PEG的浓度只需 1左右，小分子所需 PEG 浓度高达 20。本实验选择性沉淀 4.3kb 的 pBR322 质粒 DNA，每毫升加入 0.4 毫升的 30 PEG，其最终 PEG 浓度为 12。PEG 选择性沉淀 DNA 的分辨率大约100bp。9抽提 DNA 去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就
9、被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的 DNA 分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约 1015的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的 DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走 DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。10为什么用酚与氯仿抽提 DNA 时，还要加少量的异戊酵？在抽提 DNA 时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为 24：1 之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份 24：1 的氯仿与异戊醇即成） ，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。11为什么要用 pH8 的 Tris 水溶液饱和酚？呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？
