中国海洋大学博士学位论文文昌鱼体液和鱼类血清补体溶血系统比较研究姓名：王长法申请学位级别：博士专业：海洋生物学指导教师：张士璀2003.6.1中国海洋大学博士学位论文中文摘要文昌鱼体液和鱼类血清补体比较研究摘要补体的系统发育进化是当今免疫学研究热点之～虽然对补体研究已有1 0 0多年历史，但补体最早出现于哪类动物及其激活适应系统演化仍不十分清楚本文选择了在系统演化上占据主要地位的文昌鱼以及软骨鱼和硬骨鱼，对它们的补体系统进行了研究本文首次将脊椎动物血清补体溶血活性标准测定方法运用到文昌鱼体液免疫研究中，首次建立了测定无脊椎动物体液补体溶血A C H 5 0 的方法我们发现文昌鱼体液出现补体样的溶血活性文昌鱼体液可溶解悬浮在1 0 m m o l ／LE G T A ．M g ．G V B 缓冲液中的正常的兔血红细胞、绵羊红细胞、及部分哺乳动物、鸟类、两栖类和鱼类的代表动物的血红细胞；而在G V B 2 + 缓冲液中时对抗体包被的绵羊红细胞却没有溶血活性文昌鱼体液的溶血活性和靶红细胞的动物种类在系统发育上和文昌鱼的亲缘关系远近没有直接联系文昌鱼体液在E G T A ．M g ．G V B 缓冲液中对兔血红细胞发生溶血的最适条件是：温度是2 0 “ C ，最适p H 是7 ．5 ，最适M g ”的浓度是l O m m o l ／L 。
溶血活性是二价离子依赖的，热敏感的( 溶血活性热灭活温度是4 5 “ C ) 文昌鱼体液对兔血红细胞的溶血活性在受到酵母聚糖、甲胺、肼、P M S F 、E D T A 、兔抗人补体3 抗血清处理时，溶血活性消失此外，本实验还运用免疫比浊法以绵羊抗人的补体3 的抗血清检测了文昌鱼体液中的补体3 浓度为1 ．1 7 m g ／m l 此浓度和人血清及狗血清中的c 3 浓度基本相当这些结果说明：文昌鱼体液中存在着类似于脊椎动物替代途径补体样的溶血活性此外，文昌鱼体液中是否存在凝集素及其性质如何一直没有报道本文运用血细胞凝集试验证实在文昌鱼体液中存在凝集素同时还首次发现文昌鱼体液中的凝集素活性是s H 依赖型，还特异性被多个含D 一半乳糖苷的多糖抑制经注射鸡大肠杆菌后，文昌鱼体液中的凝集素对人B 、0 型红血细胞，兔、草鱼和蟾蜍红血细胞的凝集活性明显增强此结果显示，文昌鱼体内可能存在一定获得性免疫反应全世界鱼类据估计大约有2 4 ，0 0 0 种左右，其中仅有少数几种鱼类的免疫系统被系统研究过但在被研究过的少数几种鱼类中，淡水鱼类占了绝大多数，只中国海洋大学博士学位论文中文摘要有一种软骨鱼类一长鳍斑竹鲨的补体系统多年前被研究过。
本文运用脊椎动物血清补体溶血活性标准测定方法定性、定量地研究了软骨鱼条纹斑竹鲨的血清溶血补体系统发现条纹斑竹鲨血清中既存在补体经典溶血途径，又存在补体替代溶血途径条纹斑竹鲨血清A C H 5 0 和C H 5 0 值分别为2 5 7 ．2U n i t s ／m l 和3 5 ．8 ±1 3 ．1U n i t s ／m l ( n = 6 ) 条纹斑竹鲨血清对悬浮在E G T A —M g —G V B 缓冲液中的正常的兔血红细胞、绵羊红细胞、及部分哺乳动物、鸟类、两栖类和鱼类等代表动物的血红细胞具有溶血活性；在G V B 2 + 存在时对抗体包被的绵羊红细胞具有溶血活性，而在E D T A - - G V B 缓冲液中不论是对正常的兔红细胞或其他脊椎动物的红细胞还是对抗体包被的敏感绵羊红细胞都没有溶血活性此外，条纹斑竹鲨血清对不同脊椎动物红细胞的溶血活性和靶红细胞的动物种类在系统发育上和条纹斑竹鲨的亲缘关系远近没有直接联系条纹斑竹鲨血清通过补体替代途径对兔血红细胞发生溶血的最适条件是：温度是2 0 ℃，最适p H 是7 ．5 ，最适M g “的浓度是5 m M 溶血活性是二价离子依赖的，热敏感的( 溶血活性热灭活温度是4 5 ℃) 。
条纹斑竹鲨血清通过补体替代途径对兔血红细胞的溶血活性在受到P M S F 、E D T A 、酵母聚糖、甲胺、肼处理时，溶血活性消失，将条纹斑竹鲨血清预先经兔抗人c 3 抗血清处理后，其对兔红细胞的溶血活性部分受到抑制另一方面，条纹斑竹鲨血清通过补体经典途径发生溶血的特性是：需要同种鱼抗绵羊红细胞抗血清致敏的绵羊红细胞作为靶细胞：需要二价c a 2 + 和M 9 2 + 离子参与；温度是2 54 C ：作用时间是6 0分钟；该溶血过程可被特异性抑制剂如L 一赖氨酸、角叉藻聚糖、酵母聚糖、甲胺和肼所抑制实验结果显示：条纹斑竹鲨血清中存在着类似于哺乳动物经典、替代途径补体溶血系统，并且条纹斑竹鲨体内的替代途径补体溶血活性比哺乳动物的要高得多，且其溶血补体系统在低温环境下( 如0 - - 4 “ C ) 皆可充分激活，显示补体替代溶血途径在条纹斑竹鲨抵御外界病原微生物的侵染时起着重要作用较高的A C H 5 0 值可以扩大其天然免疫识别能力，弥补体内不成熟的获得性免疫能力除软骨鱼之外，我们还运用脊椎动物补体溶血途径的标准检测方法，定性、定量地研究了硬骨鱼草鱼血清溶血补体系统发现草鱼血清中既存在补体经典溶血途径，又存在补体替代溶血途径，其A C H 5 0 和C H 5 0 值分别为4 6 ．9U n i t s ／m l 和8 ．8 ±5 ．1U n i t s ／m l ( n = 6 ) 。
草鱼血清可溶解悬浮在缓冲液E G T A —M g —G V B 中的正中国海洋大学博士学位论文中文摘要常的兔血红细胞、绵羊红细胞、及部分哺乳动物、鸟类、两栖类和鱼类的代表动物的血红细胞：而对悬浮在缓冲液E D T A —G V B 中的这些脊椎动物代表动物的血红细胞却没有显示溶血活性同时还发现草鱼血清通过激活替代途径的溶血活性大小和靶红细胞的动物种类在系统发育上和草鱼的亲缘关系远近没有直接联系草鱼血清通过补体替代途径对兔血红细胞发生溶血的最适条件是：温度是2 0 C ，最适p H 是7 ．5 ，最适M g ”的浓度是5 m M 溶血活性是二价离子依赖的，热敏感的( 溶血活性热灭活温度是4 5 “ C ) 草鱼血清对兔血红细胞的溶血活性在受到P M S F 、E D T A 、酵母聚糖、甲胺、肼处理时，溶血活性消失经兔抗人补体3 抗血清处理后，草鱼血清对兔红细胞的溶血活性部分受到抑制这些实验结果显示：草鱼血清中存在着补体替代溶血途径另一方面，草鱼血清可对悬浮在缓冲液G V B ”中的经鲨鱼抗体包被的致敏绵羊红细胞显示一定量的溶血活性，且这种溶血活性可被酵母聚糖、甲胺、肼、L 一赖氨酸和角叉藻聚糖特异性抑制。
但若将这些经鲨鱼抗体包被的致敏绵羊红细胞悬浮在缓冲液E G T A —M g —G V B 或E D T A - - G V B中时，草鱼血清对其溶血活性消失这些结果显示草鱼血清体内存在补体经典溶血途径以上两方面结果表明：在草鱼体内存在着类似于哺乳动物的血清补体溶血系统，既存在着补体经典溶血途径又存在着补体替代溶血途径，同时草鱼血清能溶解经鲨鱼抗体包被的致敏绵羊红细胞，说明构成草鱼经典补体溶血途径的成分和鲨鱼血清补体溶血途径的构成成分具有一定的适合性该结果有望改变关于不同种属鱼类抗血清致敏的绵羊红细胞具有种属特异性的假设我们还发现草鱼体内替代补体途径溶血活性明显高于哺乳动物，且其溶血补体系统在低温环境下( 如0 - - 4 “ C ) 皆可充分激活，发挥防御功能，这可能与其扩大其天然免疫识别能力，弥补不成熟的获得性免疫能力有关上述研究结果表明，文昌鱼体液中存在通过替代途径激活的补体系统这是国内外首次报道到了软骨鱼，通过替代途径和经典途径激活的补体系统均已出现，而由替代途径和经典途径激活的补体系统在硬骨鱼体内获得进一步完善关健词：青岛文昌鱼，草鱼，条纹斑竹鲨，经典补体途径溶血系统，替代补体途径溶血系统，凝集素，免疫比浊法，诱导——! 里堡堂杰兰堡主兰垡笙塞茎塞塑至C O M P A R A T I V ES T U D I E SO NC O M P L E M E N TF R O M H U M O R A LF L U I DO FA M P H I O X U SA N DS E R U MO FF I S HA B S T R A C TT h ep h y l o g e n yo ft h ec o m p l e m e n ts y s t e md u r i n ge v o l u t i o nh a sb e c o m eo n eo ft h ek e yp r o b l e m si ni m m u n o l o g y ．T h es t u d i e so nc o m p l e m e n th a v eb e e no v e r10 0y e a r s ，b u ti tr e m a i n su n c l e a rw h e na n dw h i c ha n i m a li si n i t i a l l ye q u i p p e dw i t ht h ea n c e s t r a lc o m p l e m e n ts y s t e m ．H e r e ，w er e p o r tt h er e s u l t so ft h es t u d yo nt h ec o m p l e m e n ts y s t e mo f t h ec e p h a l o c h o r d a t ea m p h i o x u sa n dl o w e rv e r t e b r a t e sl i ps h a r ka n dg r a s sc a r p ．T h i sc a nh e l pU Sn o to n l yb e t t e r so u ru n d e r s t a n d i n go ft h ep h y l o g e n yo ft h ec o m p l e m e n ts y s t e md u r i n gc h o r d a t ee v o l u t i o nb u ta l s op r o v i d e sa ni m p o r t a n tl i n kb e t w e e ni n n a t ea n da d a p t i v ei m m u n er e s p o n s e s ．a m p h i o x u so rl a n c e l e t ，ac e p h a l o c h o r d a t e ，i st h ee x t e n ti n v e r t e b r a t em o s tc l o s e l yr e l a t e dt ot h ev e r t e b r a t e s ．W eh a v ei n v e n t e dat e c h n i q u et oe x t r a c tt h eh u m o r a lf l u i df r o mt h ea m p h i o x u sB r a n c h i o s t o m ab e l c h e r it s i n g t a u e n s e ．T h ep r e s e n c eo fc o m p l e m e n t - l i k ea c t i v i t yi nt h eh u m o r a lf l u i do fa m p h i o x u sW a se x a m i n e d ．T h ec o m p l e m e n tc l a s s i c a lp a t h w a y ( C P ) a c t i v i t yi sa s s a y e db yd e t e r m 。