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1、湖北中医学院硕士学位论文常见舌苔上皮细胞凋亡及其相关基因表达变化规律研究姓名：李明申请学位级别：硕士专业：中西医结合基础指导教师：吴正治2003.6.1摘要舌诊是指导中医辨证论治的重要诊断依据，舌苔是临床察舌的主要内容。 近年来的研究表明，表皮等复层扁平上皮的角质形成细胞在由基底层向棘层、 颗粒层、角质层生长、分化过程中发生了细胞凋亡，而构成舌苔的主体即舌粘 膜上皮细胞也属于复层扁平上皮。因此，我们从舌苔上皮细胞凋亡及其相关基 因表达的角度出发，在m R N A 和蛋白质两个水平探讨常见舌苔形成的机理，以 促进舌诊的客观化、微观化和现代化。方法将观察对象根据有无各系统器质性疾病及舌苔表现，分为
2、正常薄白苔、病 理薄苔、厚苔、剥苔组，每例用消毒丝瓜络用力刮取舌苔后离心、洗涤、涂片。 采用T U N E L 法检测舌苔涂片中舌粘膜上皮细胞的凋亡情况。 运用原位分子杂交技术和C M I A S 真彩色病理图像分析系统检测舌上皮细 胞中T G F B3 、b a x 、f a s 、b c 卜2m R N A 的转录水平。 应用免疫组织化学L D P 法和图像分析技术检测舌上皮细胞中T G F B3 、 B a x 、F a s 、B c 卜2 蛋白的翻译水平。结果T U N E L 法检测结果显示：四种常见舌苔其舌上皮细胞都可见细胞凋亡发生， 剥苔组的凋亡指数高于其他各组，而厚苔组的凋亡指
3、数低于其他各组( 均为P0 0 5P 00 51 4对于病理薄苔组中的薄白苔与薄黄苔，其b a xm R N A 原位杂交和免疫组化 结果均无显著差异( 表1 1 ) 。表1 1病理薄白苔与薄黄苔b a x 表达水平比较( X S )在厚苔组中，白厚苔与黄厚苔b a x 的原位杂交和免疫组化结果差异均无显 著性( 表1 2 ) 。表1 2白厚苔与黄厚苔b a x 表达水平比较( i S )上述结果表明，b a x 基因表达程度与舌苔厚度呈负相关，即b a x 表达水平 由高到低，而舌苔厚度由剥、薄到厚。但b a x 表达程度与苔色无明显关系。3 5f a s 原位杂交和免疫组化检测结果f a
4、sm R N A 和蛋白质都只在部分观察对象舌苔脱落细胞中有微弱阳性表达， 并且两个水平的表达情况一致( 分别见照片13 - 1 6 ，2 5 2 8 ) 。经z 2 检验，剥苔 f a s 阳性率高于其他各组( 均为P 0 0 5 ) 。 表1 3 不同厚度舌苔舌上皮细胞f a s 表达水平比较在病理薄苔组中，经四格表资料的精确概率法计算，薄白苔与薄黄苔f a 。 基因表达在m R N A 和蛋白质产物两个水平差异均无显著性( 表1 4 ) 。 表1 4 病理薄白苔与薄黄苔f a s 表达水平比较 望型堕壁型塑 薄白苔3阴性例数1 6合计1 9 薄黄苔11 01 1同为厚苔组，经四格表资料的
5、精确概率法计算，白厚苔与黄厚苔f a s 基因 表达在m R N A 和蛋白质产物两个水平差异均无显著性( 表1 5 ) 。表1 5自厚苔与黄厚苔f a s 表达水平比较3 6B e i - 2 原位杂交和免疫组化检测结果在各组舌苔中均未检测到b c l 一2 基因表达。4 讨论4 1 本研究指标选择的依据细胞凋亡，是程序性细胞死亡( P r o g r a m m e d C e l l D e a t h ，P C D ) 的主要方式， 是多细胞有机体为调控机体发育，维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死 亡过程。它参与机体许多的生理、病理过程，如胚胎发育、免疫调节、衰老过 程、肿瘤发生等
6、 29 1 。细胞凋亡是一个由多种基因综合作用的复杂过程，凋亡调 控基因包括促进凋亡的b a x 、f a s f a s L 、b i d 、T N F 、T R A I L 基因等，抑制凋亡 的b c l 2 、b c l x L 、N F K B 、S u r v i v i n 基因等，以及对凋亡具双向调控作用的 c - m y c 、e n d o t h e l i n s 、i n t e g r i n s 基因等。在复层扁平上皮中，上皮角质形成细胞 通过调节其增殖、分化、凋亡的过程来维持表皮结构的动态平衡【3 0 。若凋亡过 度或不足都可破坏这一平衡，导致表皮结构的改变。我们
7、推测，作为舌诊主要 内容之一的舌苔厚度变化也可能是由于凋亡过程的调节机制发生变化，导致舌 苔上皮细胞存活或凋亡的情况不同。因此我们选择与上皮细胞凋亡有密切关系 的几个基因作为研究对象： 转化生长因子B ( T r a n s f o r m i n gG r o w t hF a c t o r B e t a ，T G F - B ) 是一类多 效能细胞因子，广泛存在于动物的正常组织和转化细胞中。在人体内有T G FB1 、 T G FB2 、T G FB3 三种同源异构体，它们有类似的生物学活性( 3 ”。活性T G FB 由两个二硫键相连的同源二聚体组成，分子量为2 5 K D ，由其潜
8、活性形式前体蛋白 在酸、酶等变性剂存在的条件下N 端裂解产生。T G F l 3 通过白分泌、旁分泌和 内分泌的方式，与细胞表面的T G FB 受体结合，经过S m a d S 蛋白的信号转导作 用，激活靶基因的转录，在多种细胞的增殖、分化、迁移和凋亡中发挥重要的 调控作用”“。此外，它还参与细胞外基质的形成、调节细胞粘附以及机体的免 疫反应，并与肿瘤的发生发展密切相关 3 3 1 。T G F B 对上皮细胞凋亡具有促进作 用1 ，并且对其生长、分化起负性调节作用，可将生长细胞阻抑于细胞周期 G 1 期。”。T G F B 的三种同源异构体中，T G FBI 和T G FB2 在表皮基底层附
9、近表达较丰富，T G FD3 在颗粒层表达较多【3 ，而我们舌苔取材取到基底层细胞 相对较少，所以选择T G FB3 作为测定指标。 F a s ( F a c t o ra s s o c i a t e ds u i c i d e ) 又称A p o 一1 ，即C D 9 5 ，是在多种细胞表达 的细胞表面死亡受体，属于肿瘤坏死因子神经生长因子( T N F N G F ) 受体超 家族。人类f a s 基因位于1 0 号染色体长臂，其编码产物为分子量4 5 K D 的跨膜 蛋白。F a s 与其配体F a s L 结合后，通过F a s 的死亡效应结构域，将凋亡信号传 递至C a s
10、p a s e ，发生蛋白酶级联反应，激活的C a s p a s e 作用于不同的底物产生 不同的效应，最终导致表达F a s 的细胞发生凋亡口”。在培养的正常角质形成细 胞即有低水平的F a s 表达【3 ”，其介导的凋亡过程在维持上皮正常生理功能及皮 肤损伤修复等方面具有重要作用【39 一m 。B c l - 2 ( B c e l ll y m p h o m a l e u k e m i a 一2 ) 是原癌基因的一种，其基因定位于18 q 2 1 ，转录出的m R N A 长6 O k b ，编码产物为分子量2 6 K D 的蛋白分子。许多实验证据表明B c l 一2 可抑制多种
11、因子激发的细胞凋亡1 4 ”，延长细胞寿命，但并不 能刺激细胞增殖。B a x 也是b c l 2 基因家族成员之一，基因产物蛋白分子量 2 1 K D ，2 1 的氨基酸与B e l 一2 同源，但其生物学作用是括抗B c l 一2 。B a x 与B c l 2 各自可形成同源二聚体，也可相互作用为异源二聚体【42 1 ，两者之间的比例决定 了细胞的命运。当细胞中B a x 蛋白高表达时形成同源二聚体，可促进细胞凋亡： 而当B c l 一2 蛋白高表达时则形成B c l 。2 B a x 异二聚体，抑制细胞凋亡 4 3 1 。B c l 2 、 B a x 在各种上皮组织中表达量的异常相应
12、引起前列腺增生、银屑病、鳞癌等病 变都是目前研究的热点 4 4 - 4 6 。4 2 本研究实验方法的评价4 2 1T U N E L 法检测细胞凋亡细胞凋亡最明显的生化特征是C a 2 + 、M 9 2 + 离子依赖的内源性核酸酶激活， 使D N A 被切割而出现单股或双股断链，产生游离的3 一O H 末端 47 1 ，而T U N E L 法( 属原位缺口末端标记技术的一种) 用末端脱氧核苷酸转移酶( T d T ) 将外源 性的地高辛标记的d U T P 连接到凋亡细胞核D N A 断链的3 、O H 末端，再依次 通过与生物素标记的抗地高辛抗体、链霉亲和素生物素一过氧化物酶复合物结 合
13、，然后加入显色底物D A B 予以显示，从而检测到凋亡的细胞。此方法检测 的特异性和敏感性都较好，且操作较简便【42 1 。故在几种细胞凋亡检测方法包括 电镜观察、流式细胞仪检测、琼脂糖凝胶电泳法和原位T U N E L 法中，以T U N E L 法最为常用 48 1 。4 2 2 原位杂交检测m R N A 转录水平 原位核酸分子杂交技术( 简称原位杂交) 是应用已知碱基顺序并带有标记 物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合 而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组 织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显
14、微 镜下进行细胞内定位【4 ”。本研究中原位杂交应用地高辛高效标记的寡核苷酸探 针，特异性较强，组织穿透性好，且避免了同位素标记所伴随的半衰期短、性 能不稳定、污染环境、危害健康等缺点 S O l 。并且在实验流程中采用高温烘烤、D E P C 水处理、戴手套和口罩操作等措施严防了R N A 酶污染，最大限度地保 存了细胞内的m R N A ，使检测结果准确可靠。4 2 3 免疫细胞化学技术检测蛋白表达水平 免疫细胞化学技术又称免疫组织化学，简称免疫组化。它是利用免疫学抗 原抗体反应的原理，在原位识别细胞和组织内化学成份，然后在荧光显微镜、 光学显微镜和电子显微镜下观察细胞和组织内标记物显示出
15、的特异性抗原抗 体反应 5 ”。本研究采用L D P 法，第二抗体D A K OE n v i s i o n + 是将特异性抗体和 辣根过氧化物酶( H R P ) 结合在葡聚糖的聚合物上而成，因为二抗上的多聚物 可结合许多的H R P 分子，使信号较传统的酶标问接法有显著提高，敏感性较 P A P 法、A B C 法和L S A B 法高出几十倍，而多聚物葡聚糖是人体内不存在的， 无非特异性干扰，背景染色极低，因此该方法是一种高敏感、快速的蛋白质表 达检测方法 5 0 l 。4 2 4 图像分析指标的选择 对原位杂交和免疫组化结果采用北京航空航天大学图像分析中心和空军 总医院生物医学工程研
16、究所研制的C M I A S 真彩色病理图像分析系统进行图像 分析。选用其中的“组化分析”模块，结合使用多视场多目标统计分析功能， 测定每张涂片中的阳性细胞率( ) 和阳性目标P U 值( 阳性单位) ，从而定量 表达免疫组化和原位杂交的阳性反应强度。阳性单位值( P U 值) 越大，阳性 反应强度越大；阳性单位越小，阳性反应强度越小。采用计算机图像分析不仅 能避免判断阳性程度时受主观因素的影响，而且能得到用数值表示的量化指标 50 1 4 3 舌苔厚度变化与舌上皮细胞凋亡的关系祖国医学认为舌苔的形成，乃胃之生气所现。如章虚谷说：“舌苔由胃中 生气所现，而胃气由心脾发生，故无病之人常有薄苔，是胃中之生气，如地上 之微草也。若不毛之地，则土无生气矣。”又如吴坤安说：“舌上有苔，犹地之 有苔。地之苔，湿气上泛而生；舌之苔，胃蒸脾湿上潮而生，故日苔。”所谓 “胃中生气”即指脾健运化，胃主受纳，二者的生理功能运行正常，舌上才可 显现出一层薄润的舌苔。所以舌苔的厚薄变化
