薄层色谱法在中药标准研究工作中的应用

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1、14薄层色谱法在中药标准研究工作中的应用薄层色谱法在中药标准研究工作中的应用湖北省药品检验所 自新中国成立以来，中药经历着逐步现代化的发展过程。其中质量控制是中 药现代化的关键之一。历次版本的中国药典（ChP）就包含着这一过程的例证。一、薄层色谱在中药分析中的简单回顾一、薄层色谱在中药分析中的简单回顾 自 20 世纪 60 年代薄层色谱取代纸色谱（纸层析）技术作为一种快速、简 单、灵敏的鉴别手段应用于中药材及中成药的鉴别，薄层扫描用于许多中药及 中成药的含量测定，并收载于中国药典以来，在控制中药质量方面起到积极的 作用，已为中药生产及质量监督管理部门所广泛认同。 在早期的中国药典的版本中，只有

2、简单的化学颜色反应和显微鉴别，总灰 分和含水量测量以及总浸出物测定，偶尔有总活性部位的含量测定，比如总生 物碱，总黄酮，总皂苷等等。 薄层色谱法鉴别是在 1985 版中国药典一部被首次收载的，但由于受到 当时可获得的化学对照品的缺乏故仅限于个别的专论中。 对照药材对照药材一个始于中国药典 1990 版的突破 实践表明化学对照品的缺乏阻碍了 TLC 鉴别在草药中应用的拓展。甚至一 些多数草药共同含有的化学对照品对于质量评价来说是不太重要的。为了解决 TLC 鉴别中的瓶颈问题，对照药材(Reference Crude Drug; RCD)自 1990 版中国 药典起被引入了 TLC 鉴别项当中。众

3、所周知，TLC 的独一无二的优势是能够提 供类似图画的成像使得草药中的成分组成能够整体地被可视化。不同种属的草 药产生的 TLC 图像具有各自的专属性。 二、薄层色谱在我国应用的现状二、薄层色谱在我国应用的现状 我们在技术上则一直滞留在初始阶段的状态，逐渐与其他发达国家拉开了 距离。 我国大多数实验室依然使用实验室自制薄层板，同时多半使用的是简陋的 器材，操作粗放，长期处在“低水平，广覆盖”的状态。 三、薄层色谱在其他国家药典中的应用三、薄层色谱在其他国家药典中的应用 80 年代后期虽然各国药典逐渐倾向于应用液相色谱技术，但在草药分析领 域，薄层色谱仍然广泛地被应用，尤其是欧洲国家。他们在器械

4、、仪器、计算 机化、自动化等方面都有快速的发展。 欧洲国家草药分析实验室已放弃了自制薄层板，均改用商品预制板，以避 免因不同实验室自制的薄层板质量不一致而结果互有差异。 四、四、TLC 在在 05 版药典的应用版药典的应用 复杂体系的药物（中药、天然药）应用越来越广泛 鉴别 含量测定 中西药对 TLC 不同要求： 15 中药鉴别、限量检查、含量测定、指纹图谱分析 化学药鉴别、杂质检查 五、五、05 版药典在薄层鉴别收载方面的特点版药典在薄层鉴别收载方面的特点 专属有效的测定方式的重用 1、在已有的薄层鉴别中，增加了专属性更强的药材作对照。与对照品相比， 本版药典更强调使用对照药材做鉴别，以增加

5、整体专属性，新增的 513 个 TLC 鉴别中，使用对照药材的占 61.6%。 2、增加对照品同时作对照，使鉴别更具针对性和专属性 对照品和对照药 材同时使用，增强专属性，空白不得有干扰 3、将有较好专属性的成分替换专属性不佳的成分 六、六、05 版药典对薄层色谱法修订的重点版药典对薄层色谱法修订的重点 强调使用预制板（需特别处理和化学改性用自制板） 规范操作方法与条件 参照药典附录 增加系统适用性试验 耐用性 单波长与双波长 薄层，多用双波长去除背景影响 七、薄层分析方法的验证七、薄层分析方法的验证 1、验证的目的： 证明采用的方法是否适合于相应的检测方法 新建立的检测方法、改变原检测方法等

6、均须验证 验证过程和结果均应记载在标准起草或修订说明中 做出来的没作出来的都写，实验记录要详尽 2、需验证的分析方法 TLC 鉴别 TLC 限量检查 毒剧药，梯度点样 TLCS 含量测定 3、应进行的方法学内容 鉴别应进行的方法学内容有耐用性、重现性、专属性。 限度应进行的方法学内容有耐用性、检测限、专属性、重现性。 定量限度应进行的方法学内容有耐用性、准确度、重现性、中间精密度、 重复性、专属性、定量限、线性、范围。 4、须验证的方法学概念 专属性（专属性（Specificity） 系指在其他成分可能存在下，采用的方法能正确测定出被测成分的特性， 应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。不

7、含被测成分的供试品，以及 结构相似或组分中的有关化合物，均不得干扰测定 鉴别、限量检查、含量测定等均应考察其专属性 应附代表性图谱，以不含被测成分的供试品（除去含待测成分药材或不含 待测成分的模拟复方）试验说明方法的专属性。并标明相关成分在图中的位置16耐用性耐用性 （Robustness） 耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为 把方法用于常规检验提供依据 开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应 在方法中写明 典型的变动因素（薄层色谱法）：不同厂牌的薄层板；点样方式点状带状； 薄层展开时温度及相对湿度的变化。 经试验，应说明小的变动能否通过

8、设计的系统适用性试验，以确保方法有 效。 检测灵敏度检测灵敏度 用于限量检查时，采用供试品溶液和对照品溶液与稀释若干倍的对照品溶液在 规定的色谱条件下，于同一块薄层板上点样、展开、检视，后者应显清晰的斑 点。 分离度分离度 用于鉴别时，对照品溶液与供试品溶液中相应的主斑点，应显示两个清晰 分离的斑点。 用于限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度， 分离度（R）的计算公式为：nR=2（d2-d1）/W1+W2 d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离； d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离； W1及 W2为相邻两峰各自的峰宽。 除另有规定外，分离度应大于 1.0。 重复性重复性 同一

9、供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于 3.0%；需显色后测定的相对标准偏差应不大于 5.0% 八、薄层色谱方法研究中应注意的问题八、薄层色谱方法研究中应注意的问题 薄层色谱鉴别 以处方中药味的检出而拟定的方法，检出的具体对象是某 一味药、处方中某一成分或某一类成分。但科学合理的鉴别项目应有良好的专 属性、可操作性和重现性，并且方法应简便易行 1、薄层色谱鉴别是专属性较强的鉴别方法，可能情况应采用对照品和对照 药材的双重对照 2、对新增的对照品及对照药材应按有关规定进行研究 3、对拟定的鉴别应用另一展开剂进行验证实验 4、使用无法定来源的对照品应依法提供

10、资料 5、对照药材与取样成品中被测药材的量间对应关系 6、对所研究的色谱应以彩色照片作记录 7、薄层点样量建议不要大于 15ul,注意调整取样量及供试液制备的浓度 8、超声提取因仪器原因不要大于 30 分钟。如经实验研究后，一定要用较17长时间提取，注意提示间隔时间提取。 9、薄层色谱注意记录实验环境条件如温度湿度 10、薄层色谱加热显色时，注意加热时间对斑点显色出现多少的程度的考 察 11、薄层色谱建立，应注意尽量参考药典中相应药材的鉴别的色谱条件 九、试验中原始资料的记录九、试验中原始资料的记录 薄层色谱记录应反应出如下信息：室温及湿度；薄层板所用的吸附剂；供 试品的预处理，供试液与对照液

11、的配制；点样量；展开剂、展开距离；显色剂； 斑点的颜色，色谱示意图（同等大小）或彩色照片。 薄层扫描法：应记录薄层扫描仪的型号，注意扫描方式，扫描波长，供试 品和对照品的称量(平行试验各 2 份)及简要配制情况，点样量，测定值，并正 确地计算回归方程和结果。 实验中观察到的现象应简要记录；实验所用对照品应记录来源、批号要注 明；实验所用样品应记录批号。 对未成功的试验过程及现象亦应进行记录及分析，并在起草说明中予以阐 述。 十、实验与环保问题十、实验与环保问题 根据 ICH 的要求，对所有化学有机溶剂按其对环境影响程度进行了分类， 一共分成四类，第一类为应该避免使用溶剂，有苯、四氯化碳等；第二

12、类为应 限制使用的溶剂，有氯仿、乙腈等；第三类为 GMP 或其它质量要求限制使用 的溶剂，如丙酮、正丁醇等；第四类为尚无足够药理学资料而未限定的溶剂， 如石油醚、异辛烷等。 在实验中可考虑用二氯甲烷代替氯仿，用环已烷代替正已烷，用甲苯代替 苯。 十一、申报资料中的常见问题十一、申报资料中的常见问题 1、某些化学鉴别专属性差，应选用专属性较强的 TLC 方法。 2、某些药材的薄层层析鉴别仅用对照品作对照，专属性差，应增加对照药 材作对照。 3、多基原的药材仅以一种作对照欠全面，应考察不同基原的品种薄层层析 图谱是否均具鉴别意义。 4、未提供薄层彩色照片。 5、从提供的照片看，分离效果欠佳，应改进。 6、缺少阴性对照。 7、鉴别项目过少，应适当增加药味的鉴别。 十二、薄层色谱实验复核中的常见问题十二、薄层色谱实验复核中的常见问题 1、分离效果欠佳，色带背景较深。 2、对照与供试品色谱信息不符，主要表现在供试品色谱斑点少于对照药材。18 3、供试品与对照品（对照药材）间量的对应，常见供试品斑点明显浅于对 照品（对照药材）斑点。4、Rf 值过高或过低。