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1、中国医科大学硕士学位论文宫内窒息后新生鼠胃肠道表皮生长因子及其受体的研究姓名：孙洪伟申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：孙梅20030301中文摘要目的j 新生儿窒息是围产期常见的、对新生儿危害极大的一种疾病。该病可以发生在宫内及娩出过程中的各个环节。窒息可导致新生儿多系统的损伤。有研究发现窒息后腹腔动脉血流减少7 0 ，从而导致胃肠道严重缺血，特别是胃肠黏膜的缺血，可造成胃肠黏膜的损伤如糜烂、溃疡和出血等，更严重的是肠道缺氧可能导致坏死性小肠结肠炎( n e c r o t i z i n ge n t c r o c o l i t i s ，N E C ) 的发生。研究表明急性胃肠黏
2、膜损伤后，一些生长因子参与了一系列的修复过程。表皮生长因子( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ，E G F ) 是其中一个重要的成员，E G F 与其受体( 表皮生长因子受体，e p i d e r m a lg r o 、, a hf a c t o rr e c e p t o r ，E G F R ) 结合后激活E G F R ，从而调节生长代谢。E G F 及E G F R 对促进胃肠道发育和成熟、抑制胃酸分泌、保护胃肠细胞、减轻胃肠黏膜损伤并促进其修复有重要意义。J L 目前有关宫内窒息新生鼠胃肠道E G F 和E G F R 改变的研
3、究尚未见报道。我们对足月胎鼠进行宫内窒息后取出并让其生存，来研究窒息后新生鼠胃肠道E G F 和E G F R 随时间不同而发生的改变以了解窒息后新生鼠胃肠损伤修复的机制，从而为防治新生儿窒息后消化系统损伤提供理论依据。I 方法一、动物模型制备孕2 1 天W i s t a r 大鼠乙醚麻醉后，下腹正中开腹，暴露双角子宫及供应子宫和卵巢的动静脉血管，以无创动脉夹钳夹一侧血管1 2 0 分钟，对侧未钳夹宫角内的胎鼠为对照组( 假手术组) 。模型达规定时间后立即剖宫取出胎鼠，给予保温、吸口腔内黏液、吸氧等处理后用代乳鼠进行喂养。将存活的新生鼠按生后0 、2 4 、4 8 、7 2小时分为4 个组，
4、达规定时间后断头处死，取出胃和肠标本。二、检测方法应用免疫组化法检测胃、肠组织E G F 和E G F R 的表达，同时常规做光镜检查以了解组织学改变。应用反转录聚合酶链反应 ( R T P C R ) 检测胃组织E G F Rm R N A 的表达。所有数据用又S D 表示，应用S P S S 软件行q 检验，P 0 0 5 。窒息后O 小时组E G F 平均灰密度值较对照组无差异，P 0 0 5 。窒息后2 4 小时组E G F 平均灰密度值增加，较对照组和0 小时组均差异显著，P 0 0 5 。1 4 表1 窒息后薪生鼠胃黏膜E G F 平均灰密度篷( 叉S D ，n = 1 8 )与对
5、照组比较P ( 0 0 5 ，一P 0 0 5 。窒患瑶0 小时维囊生鼠霉黏膜平均灰密度僮较对慧组骥显减少，差异霎誊显著，P 0 0 5 。窒息后鸽小融组新生鼠胃黏膜E G F R 平均灰密度值增加更为明显，与对照组、窒息后0 小时组相比差异非常烂著，P 0 0 5 ；与窒息后2 4 小时组相比其值虽高但无显著差异，P 0 0 5 ；较窒息后O 小时组相比差异非常显著，P 0 0 5 0 窒息后0 小时组新生鼠小肠黏膜E G F 平均灰密度值较对照组无差异，P O 0 5 。窒息后2 4 小时组1 6 新生鼠小肠黏膜E G F 平均灰密度值增加，较对照组差异显著，P0 0 5 ；与对照组和窒息
6、后O 小时组比较其值仍高且差异均非常显著，P 0 0 5 。表3 窒息后新生鼠小肠黏膜E G F 平均灰密度值( X S D ，n = 1 8 )与对照组比较+ P 0 0 5 。窒息后0 小时组新生鼠小肠黏膜平均灰密度值较对照组减少，差异显著，P 0 。0 5 。窒息后4 8 小时组新生鼠小肠黏膜E G F R 平均灰密度值增加更为明显，与窒息后O小时组、2 4 小时组相比差异非常显著，P 0 0 5 ；与对照组、窒息后2 4 小时组相比差异显著，P 0 0 5 。窒息后O 小时组新生鼠胃黏膜E G F Rm R N A 半定量值较对照组减少，两组间差异非常显著，P 0 0 5 ；而与对照组
7、和窒息后2 4小时组相比差异仍非常显著，P 0 0 1 。表5 窒息后新生鼠胃黏膜E C 豫m R N A 半定量值( 置S D ，n = 5 )0 小时组2 4 小时组4 8 小时组7 1 小时组对照组O 7 3 6 0 0 ，0 3 0 50 7 0 8 0 0 0 1 9 20 7 0 4 0 O 0 1 1 4O 7 1 8 0 O 0 2 1 7窒息组0 5 7 4 0 0 0 1 1 4 1 2 0 4 0 0 0 2 0 7 0 8 2 0 0 O 0 1 5 8 0 8 0 0 0 - t - O 0 1 5 8 一与对照组比较一P 0 0 1巨G F Rm P , N A 半
8、定量值、夕夕心图5 窒息后新生鼠胃黏膜E G F Rm R N A 半定量值1 9 图片1 对照组小肠黏膜H E 染色光镜2 0 0X图片2 对照组胃黏膜肛染色光镜2 0 0x- 2 0 图片3 对照组小肠黏膜E G F 免疫组化光镜4 0 0 小肠黏膜E G F 主要定位于细胞浆中，染色呈淡棕黄色图片4 对照组胃黏膜E G F 免疫组化光镜4 0 0x胃黏膜E G F 主要定位于细胞浆中，染色呈淡棕黄色2 1 图片5 窒息：O 分钟后小肠黏膜E G F 免疫组化光镜4 0 0 细胞浆中棕黄色染色增强图片6 窒息2 0 分钟后胃黏膜E G F 免疫组化光镜4 0 0 细胞浆中棕黄色染色增强2
9、2 图片7 对照组小肠黏膜E G F R 免疫组化光镜4 0 0 小肠黏膜E G F R 主要定位于细胞膜，染色呈淡棕黄色图片8 对照组胃黏膜E G F R 免疫组化光镜4 0 0X胃黏膜E G F R 主要定位于细胞膜，染色呈淡棕黄色2 3 图片9 窒息2 0 分钟后小肠黏膜E G F R 免疫组化光镜4 0 0 细胞膜棕黄色染色增强图片l O 窒息2 0 分钟后胃黏膜E G F R 免疫组化光镜4 0 0 细胞膜棕黄色染色增强2 4 图片I i 正常胃黏膜各时间点的E G F Rm R N A 光镜加o 各时间点E G F Rm R N A 的表达接近图片1 2 窒息后胃黏膜各时间点的E
10、G F Rm R N A 光镜4 0 0 0 小时组E G F Rm R N A 的表达明显减少，2 4 小时组则最强2 5 讨论研究表明一1 急性损伤后胃肠黏膜结构的重建需要各种细胞和结缔组织成分相互作用的平衡以及控制这些成分的生长因子的 激活。在损伤后胃肠黏膜结构重建的初期，细胞增殖的加速最可能是由作为促有丝分裂肽的E G F 和或转化生长因子仅( T G F a ) 引起的。因此我们研究E G F 及E G F R 在窒息所致新生鼠胃肠黏膜损伤后修复过程中是否发生改变，以探讨其在窒息后新生鼠胃肠黏膜损伤修复机制中的作用，从而为临床防治窒息后新生鼠消化系统损伤提供理论基础。 E G F 最
11、初是在雄眭小鼠颌下腺提取物中发现的，而后人们发现从人尿中提取出的一种能抑制胃酸分泌的物质( 即尿抑胃素) 的化学结构和生物活性与鼠的E G F 极为相似，这就是人类的E G F 。E G F 广泛存在于消化道的黏膜层以及乳汁、唾液、胃和十二指肠液、胰液、胆汁等人体组织和体液中。E G F 是一种强烈的细胞分裂刺激物，主要作用是促进上皮细胞的增殖与分化，对胚胎的发生和生长、组织修复和再生均有调节作用o t o 。E G F 需要与其受 体E G F R 结合才能发挥其生物学作用。E G F R 是分子量为1 7 0 K D ，属于膜相连的受体酪氨酸激酶，由细胞外区、跨膜区和细胞内区组成。其广泛存
12、在于胃肠黏膜的上皮层L 1 2 j 。研究发现E G F R 是鼠胚胎早期消化道发育成熟过程中不可缺少的一种物质 1 3 , 1 4 。E G F 识别E G F R 细胞外区上的高度选择性结合位点并与之结合，激活细胞内区的酪氨酸激酶，引发众多底物磷酸化从而导致一系列级联反应：增加黏液蛋白的生成，促进上皮细胞的移行，促进D N A 、R N A 及蛋白质的合成和细胞的有丝分裂，由此发挥着调节2 6 胃肠道的作用，如加速宫内胎儿消化道的成熟、营养胃肠道_ 以及促进急性胃肠黏膜损伤后的修复等。多数研究发现E G F 及其受体E G F R 能刺激胃肠黏膜细胞的整复及增殖、抑制胃酸分泌、增加胃黏膜血
13、流，促进急慢性胃肠损伤的愈合【1 5 “ 。但亦存在不同观点，H u a n gF S 等唧1 研究发现在 给予氟尿嘧啶后引起功能性灭活E G F R 鼠的小肠损伤后，E G F 及E G F R 未发挥促进小肠损伤愈合的重要作用。我们的研究发现窒息组新生鼠生长缓慢，并伴有胃潴留。组 织学发现窒息2 0 分钟后0 小时组新生鼠胃肠黏膜与对照组相比无明显改变，为基本正常黏膜。但随日龄增加，胃肠黏膜逐渐出现黏膜上皮水肿、炎性细胞浸润、甚至部分上皮脱落等改变，于生后4 8 小时病变最重，之后逐渐恢复。临床上窒息后新生儿消化系统亦表现出这种由轻到重再逐渐恢复的变化。本实验显示新生鼠正常胃黏膜在黏膜胃腺
14、颈区( 增殖带) 、主细胞、壁细胞和胃腺底部可见较弱的E G F 和E G F R 表达，而在窒息组胃黏膜则有强的E G F 和E G F R 表达，表达范围扩大，有时平 滑肌细胞亦有表达。新生鼠正常小肠细胞的顶膜及基底膜均有较弱的E G F R 表达，而在窒息组小肠细胞的顶膜及基底膜可见较强的E G F R 表达。这与国外报道I 1 2J 一致。表明黏膜损伤后肠腔 中的E G F 等配体能有效的与小肠细胞顶膜的E G F R 结合，并且由于生后初期肠道通透性增加使得E G F 等配体能快速穿过肠道上皮到达上皮基底层的E G F R 并与之结合，从而发挥生物学效应。 本研究发现窒息后新生鼠胃肠
15、黏膜E G F 和E G F R 的表达随日龄增加而逐渐增高，在胃肠黏膜病变最重时即生后4 8 小时时达 高峰，之后二者开始逐渐下降。而窒息后新生鼠胃黏膜E G F R m R N A 的表达则在生后2 4 小时达高峰，之后逐渐下降。表明窒息引起新生鼠胃肠黏膜损伤后，E G F 和E G F R 的表达增多，二者结合 后可引起胃肠黏膜细胞增殖等反应，由此促进胃肠损伤的愈合。2 7 说明E G F 和E G F R 在窒息引起的新生鼠胃肠黏膜损伤后的修复中发挥重要作用。这与多数研究结果相一致。K o n t u r e kP C 等引 用1 0 0 乙酸诱导成年大鼠制成胃溃疡模型，研究发现胃黏膜
16、E G F 和E G F R 在O 天组无表达，于4 天时达高峰，之后开始下降， 而E G Fm R N A 的表达在2 天时达高峰。我们的研究结果在胃肠黏膜E G F 和E G F R 达高峰的时间点上与其不一致，考虑可能是由于所用动物模型不一致而造成的。此外，近年来国外研究2 一u 发现预先给予E G F 能减少急慢性胃肠道损伤的发生以及降低损伤的严重程度，说明E G F 及E G F R 具有保护胃肠黏膜、减轻胃肠黏膜损伤的作用。这些研究提供了一种潜在的预防和治疗消化系统损伤的新方案。目前急性胃肠黏膜损伤引起包括E G F 在内的生长因子增多的机制尚不明确。M i y a z a k iY 等忙副研究发现过氧化氢和山梨醇 等应激因素可导致鼠胃上皮细胞株中的E G F R 在两分钟内发生酪氨酸磷酸化，之后出现生长因子的增多。而在功能性灭活E
