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1、酶切反应注意事项酶切反应一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即 10 个单位的内切酶可以切割 1g 不同来源和纯度的 DNA。通常，一个 50l 的反应体系中，1l 的酶在 1X NEBuffer 终浓度及相应温度条件 下反应 1 小时即可降解 1g 已纯化好的 DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间； 如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过 16 小时）也可完全反应。二、 选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物 DNA 上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶 比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个 GC 含量 50%的 DNA 链
2、，一个识别 4 个碱基 的酶将平均在每 44（256）个碱基中切割一次；而一个识别 6 个碱基的酶将平均在每 46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3或 5突出端），也可以是平 端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连 接。相关信息参见目录的 Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends 一文。三、 酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加 入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频 率而定。例如，超螺旋和
3、包埋法切割的 DNA 通常需要超过 1U/g 的酶才能被完全切割。参 见目录第 244 和 264 之“切割质粒 DNA“和“包埋法切割 DNA“。四、 DNA待切割的 DNA 应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰 酶的活性。DNA 的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第 252 页至 253 页之甲基化相关内容。五、 缓冲液对于每一种酶 NEB 都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎 100%的酶活性。使用时的缓冲液 浓度应为 1X。有的酶要求 100g/ml 的 BSA 以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应 提供 100X 的 BSA
4、（10mg/ml）。不需要 BSA 的酶如果加了 BSA 也不会受太大影响。关于缓 冲液更详细的信息参见第 234 页。六、 反应体积内切酶活力单位的定义是：1 小时内，50l 反应体积中，降解 1g 的底物 DNA 所需的酶 为一个活力单位。因此酶：DNA 的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在 5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的 10%（一般酶都贮存于 50%的甘油中）。七、 混合这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐 用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可
5、振 荡！八、 反应温度大部分酶的反应温度为 37C；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为 50-65C 不等。参看第 244 页 Activity of thermophiles at 37C。九、 反应时间1 酶活单位的定义时间为 1 小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之， 如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。参见第 241 页酶在反应中的存 活时间。十、 终止反应如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在 NEB 我们使用如下反应终止液： 50%的甘油，50mM EDTA（pH8.0），和 0.05%溴酚蓝（10l/50l 反应液）。如
6、果要进行 下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65C 或 85C，20 分钟）。热失活并不能适 用于所有的酶，详情参见第 240 页热失活表。此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。十一、贮存大部分酶应贮存于-20C。少部分酶则须在-70C 长期保存。详情请参见相关酶的 DATA SHEET 或目录相关部分。10X BUFFER 和 100X BSA 于-20C 保存。BSA 不能与 NEBuffer 混 合后保存，否则将会出现 BSA 沉淀。十二、稳定性每隔 1-2 个月都会对所有的酶有一个活性检测；最近的一次检测结果将被贴在售出的每一 管酶上。通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在推荐的
7、保存缓冲液里在-20C 条件 下十分稳定。高于-20C 条件下稳定性将有所降低。 十三、对照反应如果发现您的 DNA 底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：将不加内切酶的底物 DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照 DNA（有多个已知酶切位点） 同时进行反应。若实验结果表明底物 DNA 降解，则说明 DNA 在纯化过程中或反应液里引入 了核酸酶污染；若实验结果发现底物 DNA 保持完整，而对照 DNA 被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照 DNA 和待切底物 DNA 混合起来再次进行反应，以确定样品 中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA 或酚），则混合物里的对照 DNA 也 无法被切开。 鸡蛋 鲜花 握手 雷人 路过
