各种酶活性测定方法

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1、各种酶活性测定方法第一第一 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶 SOD 测定测定 一、原理 超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴 离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确 定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下 极易再氧化而产生 O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在 560nm 处有最大吸收。 而 SOD 可清除 O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明 酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设

2、备及试剂 （一）材料；水稻或小麦叶片 （二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管 处照度为 4000Lx） ；5.试管或指形管数支。 （三）试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8） ；2. 130mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液：称 1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至 100ml；3.750mol/L 氮蓝四唑溶液：称取 0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定容至 100ml，避光保存；4. 100mol/L EDTANa2溶液：称取 0.03721gEDTANa2用磷酸缓冲液定容至 1000ml；5. 20mol/L 核

3、黄素溶液：称取 0.0753g 核黄素用蒸馏水定容至 1000ml 避光保存。三、实验步骤 1. 酶液提取 取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，1ml 预 冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为 5ml。取 1.52ml 于 1000rpm 下 离心 20min，上清液即为 SOD 粗提液。 2. 显色反应 取 5ml 指形管（要求透明度好）4 支，2 支为测定管，另 2 支为对照管，按 下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L 磷酸缓冲液 1.5130mmol/L Met 溶液 0.313mmol/L 750mol/L

4、 NBT 溶液 0.375mol/L 100mol/L EDTANa2液 0.310mol/L 20mol/L 核黄素 0.320mol/L 酶液 0.052 支对照管以缓冲液代 替酶液蒸馏水 0.25 总体积 3.0 混匀后将 1 支对照管置暗处，其它各管于 4000Lx 日光下反 应 20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长） 。 3. SOD 活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的 吸光度。四、结果计算 已知 SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原的 50为一个酶活性单位表示，按下式计算 SOD 活性。SOD 总活性(AckAE)V/

5、(Ack0.5WVt) 上式中，SOD 比活力SOD 总活性蛋白质含量式中 SOD 总活性以每克鲜重酶单位表示； 比活力单位以酶单位mg 蛋白表示 Ack 照光对照管的吸光度 AE 样品管的吸光度 V 样品 液总体积（ml）Vt 测定时样品用量（ml）W 样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg 蛋白g 鲜重。SOD、POD、CAT、MDA 的测定方法-非试剂盒法 缩写：缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛； PVP：聚乙烯吡咯烷铜 K-30；L-Met：甲硫氨酸； NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液

6、1.1. SODSOD 的测定方法的测定方法 加样顺序：（加样顺序：（V=3mlV=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3ml NBT: 0.3ml EDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml 试剂配制：试剂配制： (1) 0.05mol/L PBS：pH7.8 (2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met 用 PBS 定容至 100ml (3) 750mmol/L NBT: 0.06133g 用 PBS 定容至 100ml(避光保存避光保存) (4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g

7、用 PBS 定容至 1000ml (5) 20umol/L 核黄素: 0.0753g 用蒸馏水定容至 1000ml(避光保存避光保存) 注：（注：（1 1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管 (2)(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定 A560A560 值值 2.MDA2.MDA 的测定方法的测定方法 试剂配制：试剂配制： （1）5% TCA： 5g 用蒸馏水定容至 500ml （2）0.5% TBA：2.5g 用 TCA 定容至 500ml 方法：方法： 酶液 1ml3ml0.

8、5%TBA 和 5%TCA混合后在 100 度水浴煮沸 1515min迅速冷却，10000r/min 离心 10min用蒸馏水调零分别测定上清液在 532nm、600nm 处的吸收值 3.POD3.POD 的测定方法的测定方法 试剂配制试剂配制： （1）0.1mol/L 的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB 得到 100mlph5.4 的醋酸缓冲液A(0.2mmol/L 的 HAc 溶液)6ml 冰醋酸溶到 494ml 蒸馏水中B(0.2mmol/L 的 NaAc 溶液)13.6gNaAc.3H2O （2）0.25%愈创木酚溶液125um 愈创木酚溶于 50ml 50%乙醇中（临用前配制

9、临用前配制） （3）0.75%H2O2 溶液：1.25ml 30% H2O2 定容至 50ml（临用前配制临用前配制） 方法：方法：比色杯中依次加入 2ml 0.1mol/L 的醋酸缓冲液1ml 0.25%愈创木酚溶液xml 酶 液（5min 值为 500-800 即可）0.1ml 0.75%H2O2 溶液迅速巅到混匀把 A460 调零并开始 计时1 次/30s,连续读取 3min 4.CAT4.CAT 的测定方法的测定方法 试剂配制：试剂配制： (1) 50mmol/L 的 PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O21ml H2O2 定容至 100ml 方法方法：(1)以不加 H2O2

10、 的 50mmol/L 的 PBS（pH7.0）为空白把 A240 调零 (2)50ul 酶液3ml 50mmol/L 的 PBS（pH7.0）0.2ml 0.3% H2O2迅速颠倒混匀，开始 计时1min 后在 240nm 下比色，1 次/1min(连续读取 5min)。 2010 年 06 月 22 日 星期二 19:331 叶绿素含量测定：叶绿素含量测定： 80的丙酮液的配制：4L 丙酮 + 1L 蒸馏水。 称 0.5g 左右的叶片放在 50ml 的离心管（做三个重复） ，加入 25ml 浓度为 80的丙酮液， 放在黑暗处浸提大约 36 小时后取出，稀释 4 倍后分别在波长 663nm、

11、645nm、652nm 和 470nm 下测定光密度，以 80的丙酮液为空白。 （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理 学实验指导,P3536） 也可用 95%乙醇溶液，在 665、649、470nm 处有最大吸收峰Ca=13.95D665-6.8649 Cb=24.96D649-7.32D665 Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/2452 抗氧化酶活性的定：（抗氧化酶活性的定：（2.5g 样）样） 0.05mol/L 磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO412H2O + 2.65285g NaH2PO42H2O, 定容到 4L

12、。 （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指 导 ，P134） 。 取低温保存的鲜样，称 2g 左右的叶片（或根）放在 50ml 的离心管，加入 20ml 浓度为 0.05mol/L 磷酸缓冲溶液（pH=7.8） （最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使 酶失活） ，研磨（用磨碎机磨） ，8000r/min 的冷冻离心机下离心 20 分钟，上清液为粗酶液。2.1 丙二醛（丙二醛（MDA）的测定：）的测定： 20三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称 200g 三氯乙酸，用蒸馏水定容到 1000ml。 （参考陈 建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P124） ； 0.5% 硫代巴比妥酸（T

13、BA）溶液的配制：称 5g 硫代巴比妥酸（TBA）,用 20三氯乙酸 （TCA）溶液溶解并定容到 1000ml。 （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导 ,P124） （先加少量的氢氧化钠 1mol/L 溶解） ； 0.5ml 酶液（对照用 0.5ml 的 0.05mol/L pH=7.8 的磷酸缓冲液代替酶液） （做三个重复）+ 3mlTBA振荡沸水浴上反应 30min冷却（至少 30min）比色 （OD600、OD532、OD450） 。 （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导 ， P124） 2.2 超氧化物歧化酶（SOD）的测定： NBT(400ml)混合反应液: 392m

14、lPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g 甲硫酸铵+8ml 核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na 溶液 （100mlPBS 缓冲溶液中含 0.01204g 核黄素） 。 （另配）100ml PBS 溶液加 EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na 测试时：取 3ml 反应液+0.05ml(根)或 0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中 6-10 分钟， OD650 下测定吸光度。 2.3 过氧化物酶（过氧化物酶（POD）的测定：）的测定： 0.05mol/L 磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO412H2O + 3

15、.042975g NaH2PO42H2O,定容到 1000ml。 0.3%H2O2 溶液的配制：吸 2.5ml 30%H2O2，用 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS)定容 到 250ml。 0.2%愈创木酚溶液的配制：称 0.5g 愈创木酚，用 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS)定 容到 250ml。2ml 0.3%H2O2 溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液 (PBS) + 0.02ml？（原来为 0.01）酶液（根加 0.05ml 酶液） （对照用 0.05mol/L 磷酸缓冲

16、 溶液代替酶液） （做三个重复） ，记录 470nm 处 OD 降低速度。将每分钟 OD 增加 0.01 定义 为 1 个活力单位。 （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P121） 比色时加酶液，混合后即刻计时。 2.4 脯氨酸的测定脯氨酸的测定 标准曲线的制作： 编号 1 2 3 4 5 6 7 标准脯氨酸的量（ml） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 H2O（ml） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 冰乙酸（ml） 2 2 2 2 2 2 2 显色液（ml） 3 3 3 33 3 3 脯氨酸含量（l） 0 1 2 4 6 8 10 0.5ml 酶液（对照用 0.5ml 80乙醇代替） （做三个重复） + 1ml 冰乙酸 + 1.5ml 显色 液混匀，沸水浴 15min，冷却后测 OD520。 2.5 可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的可溶性蛋白的测定（参