口蹄疫诊断技术规程

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1、口蹄疫诊断技术规程口蹄疫诊断技术规程 （NYNYSY150-2000SY150-2000 ) )1范围 本规程规定了口蹄疫正向间接血凝试验、屠宰品中口蹄疫病毒检测试验及 口蹄疫病毒 RT - PCR 检测试验。正向间接血凝试验适用于口蹄疫疫苗接种血清 抗体水平监测、流行病学调查和进出口动物检疫；口蹄疫病毒检测试验和 RT - PCR 检测试验适用于猪的屠宰品中的口蹄疫病毒检测。 2正向间接血凝试验 2.1 试剂 2.1.1 纯化灭活口蹄疫病毒致敏醛化蹂酸化绵羊红细胞，标准阳性、阴性血清， 由中国农业科学院兰州兽医研究所生产。 2.1.2 稀释液，配制方法见附录 A。 22 操作方法 2.2.1

2、 待检血清的灭活 将待检血清放人 56水浴中灭活 30 分钟。 2.2.2 待检血清的稀释 用稀释液将待检血清稀释成 1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128， 1：256，1：512 等 8 个稀释度。2.2.3 阴、阳性血清的稀释 用稀释液将阴性对照血清稀释成 1:16，将阳性对照血清稀释成 1：5120 2.2.4 加样 在干净的 V 型 96 孔 110血凝板的第 18 孔加各稀释度待检血清 501，第 10 孔加 1：16 的阴性对照血清 501，第 11 孔加口蹄疫 O 型阳性对照血清 （1:512) 501；第 12 孔加稀释液 501（空白对照孔） 。第 18

3、孔和 1012 孔加口蹄疫诊断液，每孔 25l。 如用液体诊断液，只需摇匀便可加样。若用冻干诊断液，则需提前 710 天加人稀释液（每瓶 5m1 )浸泡（在 46下） ，方可使用。 2.2.5 振荡混匀 加样完毕后，立即将血凝板置于微量振荡器上，振荡 1 分钟，取下放在白 纸上，观察血球应均匀悬浮，不得沉淀，否则应继续振荡。 2.2.6 静置 振荡混匀后，取下血凝板并盖上大小适中的玻璃板，防止水分蒸发，室温 下静置 1.52 小时，或次日判定结果。 2.3 结果判定 2.3.1 先观察对照孔，第 10 孔（阴性血清对照孔） 、第 12 孔（稀释液对照孔） 应无凝集现象，呈小圆点状（一） 。2.

4、3.2 第 11 孔（阳性血清对照孔）应有 50以上的血球产生凝集，即（） （阳性反应） 。 2.3.3 在对照孔合格的情况下，观察的第 18 孔，以红血球呈“”凝集的 待检血清的最大稀释度为其抗体效价。例如，第 1 排的第 3 孔出现 “”凝集（90100红血球发生凝集） ，第 4 孔呈“”凝集 （75凝集） ，第 5 孔呈“十”凝集，第 6 孔呈“”凝集，则判定该份血清 中的口蹄疫抗体效价为 1：64（第 5 孔） 。 2.4 抗体效价与抗感染的关系：口蹄疫 O 型抗体 1：128 以上为免疫合格。 3屠宰品中口蹄疫病毒检测 3.1 材料准备 3.1.1 器材：高速冷冻离心机、普通离心机、

5、组织匀浆器、旋涡振荡器、V 型 (1350) 96 孔微量反应板、微量振荡器、盐水接头、8 号注射针头（磨成平口） 、 橡胶乳头。 3.1.2 健康成年家免血清：62水浴 30 分钟灭能，冻结保存。 3.1.3 口蹄疫 A，O，C，AsiaI 四型的红细胞诊断液及标准抗原，由中国农业 科学院兰州兽医研究所生产，按说明书使用。 3.1.4 被检材料的采取、输送和保存：在肉联厂、屠宰场等地采取材料，以采 取淋巴结和脊髓为主。每种样品 35 克，装入小瓶置冰瓶中送往试验室。试验 室收到材料后，立即向小瓶内装入被检材料 45 倍量的 50甘油、pH7. 6 的 0 . 05mo1/L 磷酸一缓冲液（配

6、制法见附录 B）置2 0保存，并详细记载材 料名称、来源、采集时间、地点及保存条件。 3.1.5 试验用乳鼠：每个样品应准备一窝 10 只 23 日龄吮乳小白鼠并带母鼠。3.2 操作方法3.2.1 被检材料的处理： 3.2.1.1 取 1 克左右的淋巴结和脊髓等，分别用 pH7. 6 ，0.05mol/L 的磷酸缓 冲液洗二次，用灭菌滤纸吸干，剥去被膜，称取 0.5 克。每 20 份样品随机混合 为一份混合样品，加少许石英砂研细，加 pH7.6, 0.05mol/L 磷酸缓冲液 89ml，制成 1：10 悬液，再加人 10000 单位毫升的青霉素、链霉素 1 毫升， 置 4冰箱过夜。 3.2.

7、1.2 三氯三氟乙烷（F113)处理：将 3.2.1.1 中制备的悬液，以 8000r/min 4离心 30 分钟。取上清液置组织匀浆器的搅拌缸中，加人 20% (V/V）低温预冷 F- 113，以 1000012000r/min 搅拌 15 分钟，将溶液移人离 心管，8000r/min 4离心 20 分钟，吸取水相于三角瓶中，并量体积。 3.2.1.3 聚乙二醇（PEG）浓缩：按 3.2.1.2 中制备的溶液容积加人 10% (V/V） 的 PEG (MW6000）溶解，置 46 小时或过夜。或加入等体积的饱和硫酸铰 （饱和度 50%pH7.6，配制方法见附录 C) 4过夜。而后 8000r

8、/min4离心 30 分钟，去上清，沉淀用 pH7. 6 , 0.05mol 几的磷酸缓冲液悬浮至 4ml，4过夜，再以 8000r/min4离心 30 分钟，其上清即为 25 倍浓缩的病毒液。 3.2.1.4 再次用 F- 113 处理：将 3.2.1.3 中的病毒浓缩液移人离心管，加入 20(V/V) F 一 113，置旋涡振荡器振荡 5 分钟，再以 8000r/niin 4离心 30 分钟，吸取水相，加 1000 单位嚎升的青霉素、链霉素 1 滴，用于接种乳鼠。 3.2.2 乳鼠增毒：每份被检病毒浓缩液，接种 23 日龄乳鼠 10 只，每只皮下 注射 0.2ml，与母鼠同窝，于温暖的室内

9、观察 5 天，随时收集发病或濒死鼠， 置20保存。 3.2.3 反向被动血凝法鉴定毒型 3.2.3.1 死亡鼠病毒悬液的制备：取死鼠胭体，用 pH7.20.11mol/L 磷酸缓冲液 （配制方法见附录 D)研磨成 1:3 悬液，4过夜，再 4000r/min 离心 30 分钟， 取上清 58水浴灭能 40 分钟，置 4稍冷后再次离心，取上清作为鉴定毒型的 病毒液。 3.2.3.2 反向被动血凝： a死亡鼠病毒液稀释：用 pH7.2, O.llmol/L 磷酸缓冲液将病毒液稀释成 8 个滴度：1：6；1：12；1：24； 1：48； 1：96； 1：192；1：384；1：768。 b反向被动血

10、凝操作：每份检样占四排孔、每排的 18 孔加各稀释度的 检样病毒液，用 8 号磨平针头，从第 8 孔开始加第 8 个滴度，每孔加 2 滴，直 至加到第 1 孔的第一个滴度（1:6)。每排第 9 孔加稀释液 2 滴作为阴性对照， 每排第 10 孔分别加 A,O, C, AsiaI 四型标准抗原各 2 滴，作为阳性对照。 将各型红细胞诊断液摇匀，于反应板的第一排至第四排分别滴加 A, O, C, AsiaI 型诊断液各 1 滴，置微型振荡器上振荡 34 分钟，再置室温 1.52 小时后判定。 3.3 结果判定3.3.1 判定标准 ：100凝集，红细胞均匀的分布于孔底周围。 ：75 凝集，红细胞均匀

11、的分布于孔底周围，但孔底中心有红细胞 形成的针尖大小的小点。 ：50凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，孔底有一红细胞沉下 的小点。 ：25凝集，孔底周围有不均匀的红细胞分布，但大部分红细胞已沉淀 于管底。 ：红细胞完全沉积于管底成一圆点。 3.3.2 结果判、 3.3.2.1 观察反应板上各排孔的凝集图形，四排孔中，任何一排的试验孔全凝 集，而阴性对照不凝集，阳性对照凝集，其他三排试验孔不凝集，此时被检样 品即为该排对应的毒型。 3.3.2.2 使红细胞诊断液凝集达（十）以上者的抗原最高稀释度为其凝集价，任何一排孔的凝集价高于其他三排孔的凝集价 2 个对数（以 2 为底）滴度以上 时，则判为

12、与该排对应的毒型。 4.RTPCR 4.1 引物：VPIA, VPjB，由中国农业科学院兰州兽医研究所生产。按说明书使 用。 4.2 操作方法 4.2.1 样品处理 4.2.1.1 组织样品：在无菌室内将组织样品（淋巴结，脊髓，肌肉，水泡皮等） 加灭菌石英砂磨碎，以灭菌 PB (0.04mol/L, pH7.4)制成 1:5 悬液，室温放置 2 小时以上，或 48冰箱过夜。3000r/min 离心 5 分钟，取上清液作为检测 样品。 4.2.1.2 OP 液样品：将 OP 液倒人灭菌离心管中，然后加人至少 1/3 体积 的 TTE，用高速匀浆器（10000r/min )乳化 1 分钟，如不立即

13、进行试验，样品 液要存放在70 4.2.2 总 RNA 的萃取用容量为 1. 5m1，预先经 0.1%DEPC 处理过的塑料管提取。 4.2.2.1 取被检样品液 300l。 4.2.2.2 加变性液 300l。充分混匀后冰水浴 5 分钟。 4.2.2.3 加 2M 醋酸钠 60l，混匀。 4.2.2.4 加酚氯仿异戊醇混合液 800l。充分混匀后冰水浴 5 分钟。 4.2.2.5 8000r/min 离心 10 分钟，将上层水相转人另一洁净管中。加 800l 预 冷的异丙醇。混匀后置80 1 小时，或204 小时以上或过夜。 4.2.2.6 12000r/min 离心 10 分钟。尽可能倒干

14、液体留下沉淀物。 4.2.2.7 加 800l75乙醇，轻轻摇荡 23 次后再 12000r/min 离心 8 分钟。倾 去液体，晾干后的沉淀物即可用于反转录。4.2.3 反转录（Reverse transcription，RT)反应液总量 20 川。向 RNA 沉淀管中加人：A引物（5pmol. ) 5lB. DEPC 一 ddH2O 9l 70水浴 510 分钟，然后再加C. dNTP (2.5mmol ）1lD. AMV RTase（IOU 乍 1) 1lE. 5RT 缓冲液 4l高速离心 10 秒，置 42水浴中温育 6080 分钟。 4.2.4 PCR 扩增 4.2.4.1 样品 P

15、CR 的扩增反应液总量 50l，反应开始，先将反转录产物转人 PCR 扩增专用的小塑料 管中。A. RT 产物 20lB引物 VPIA (12.5pmol ) 2lVPIB（12.5pmol）2lC. DEPC 一 ddH20 18.5l置沸水中 10 分钟。随后置冰水中骤冷，再加人：D. dNTP (2.5mmo1）4lE. 10 X PCR 缓冲液 3m1F. Taq DNA 聚合酶（5U/l) 0.5lG矿物油 50l 离心 10 秒钟将反应管插人扩增仪中，指令已设定的程序开始工作。扩增 反应共 30 个循环，每个循环包括变性 94 1 分钟，退火 55 1 分钟，聚合 72 1. 5 分钟，最后一次聚合延长为 10 分钟。如用 0.2ml 薄壁管，反应时间可 缩短 1/3。 4.2.4.2 对照质粒 DNA 的 PCR 扩增 a质粒 DNA (2g/l) 2l b引物 VPIA (12.5pmol ) 2l VP1B（12.5pmol) 2lc . DEPC-ddH20 31.5l 沸水浴 10 分钟。然后再加：d.dNTP (2.5mmol）