《可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备》由会员分享，可在线阅读，更多相关《可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、!“ 卷! 期 #$“ 年 % 月 ! 日微生物学报 !“#$ %*=?作者简介： 杨兵 （/0“0 A ） ， 男， 安徽安庆人， 硕士研究生， 研究方向为病毒基因工程疫苗。546783： B7+732 )L %(#(0，MK)）摘要： 构建可表达 ) 亚型人呼吸道合胞病毒 （:*67 N2,O8N7-CNB ,B?B-873 E8N*,，PKQ）融合蛋白 （F*,8C ONC-28，R） 的辅助病毒依赖型腺病毒载体 （:23O2N42O22- 72CE8N73 E2?-CN， GD)） ， 并完成大量制备、 纯化和 R 蛋白的体外表达鉴定。将带有 JIQ 启动子序列的 R 基因亚克隆至克隆
2、载体 OKJ/， 鉴定正确后， 克隆至 GD) 质粒 OKJ/(S， 构建OKJ/(STR GD) 重组质粒， !“#!消化 OKJ/(STR 去除原核复制元件及抗性基因， 获得 GD)TR DU) 分子， 经磷酸钙 共沉淀法转染 #0.JN2! 细胞， /? 由石长信构建。!“!“$主要试剂： 限制性内切酶 !“#!、 A+$%#!、!+?， 切胶回收目的片段， 进行连接、 转化、 挑菌和摇菌。 提质粒分别用 3)“(!、 /%0-!、 /%0-“、 456F#、!78!进行酶切鉴定， 将重组质粒取名为 *.=9?;?;8S *NM;细胞感 染,45=$BK 细胞， 置 5VW =X,培养箱
3、继续培养。约,K Y V,T后， 细胞完全病变、 脱落， 收集脱落后的细胞 及上清， 转移至 9Q1 离心管中， ,SSS$;Q“2， 离心Q“2。弃部分上清， 保留约 KQ1， 用吸管重悬沉淀， Z SW冰箱， 冻存 5SQ“2， 5VW水浴融化， 获得 IS 代 (60F;S ,SQQ 培养皿培养 ,45=$BK 细胞， 待细胞丰度约为 4SU时， 取 (60F;+0J_0_JJ_=00J=J=0+5，下 游 引 物 （2OVK9+2OV,9）+J0=0_ J_J0_JJ0=0=J_+5。以 细胞总 -70 为模板， 按逆转录试剂盒说明书进行操 作， I=- 反应条件： 4KW 5Q“2；
4、 45W 9Q“2， W 9Q“2，V,W 9Q“2， 进行 5S 个循环； V,W 9SQ“2。于 9U的琼 脂糖凝胶电泳鉴定 I=- 产物。同时用总 -70 为模 板， 直接 I=- 扩增作为阴性对照。!“567897:; 9 鉴定 纯化的 (60F;S%1 的细胞裂解液振荡混匀， 反复冻融 5 次， 9KSSS$;Q“2、 5SQ“2， 取上清， 进行 .6.+I0_) 分析， 转 膜后用 -./ 多抗进行 BGOB$2 ?ABC?3 0DBC? 749EF6 ;M4* $ N496475 $F;63 H3 B7;6415=87J47； 0D C4FF F9864 ;9864 ;9864
5、 ; 95:618F G17E9 85* ;6K47 749%1786;7G17E9493!“#$%5 O0# X 0-D - O1=;49 Q(， C87$;54FF X Q96785 Y3 Z=%8:6 ; 749%1786;7 95:618F G17E9 15 :K1F*745 F1G152 15 *4G4F;%4*:;E5671493 !“#$%5 O0W X -#DSWT(V R152 “- 37#*1 （?=） ) A 5，O#-0-5 PQ) ?#，“0$,0 VE，Y75+5aAMO 7+8F，C( 7+R10$,$,$,$*% *= 4:5ZR?“; -+2 B= 3-/7+ZR?“;； B&371&2：KU P&9#*-#: KSSTHUX杨兵等： 可表达人呼吸道合胞病毒融合蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建与制备)c微生物学报 （KSST） IT （I）
