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1、1江苏省高等学校大学生实践创新训练计划项目申请表项目名称含非天然氨基酸的绿色荧光蛋白的性质研究项目所属 一级专业门医学项目所属 二级专业类药学项目类型（） 个人项目 （） 团队项目项目实施时间起始时间： 2009 年 5 月 完成时间： 2010 年 5 月姓名年 级学校所在院系 /专业联系电话E-mail王楠溪07中国药科大学理科基地13776662290gtf_主 持 人周婕07中国药科大学理科基地13851892011gtf_杨辰07中国药科大学理科基地15850682242gtf_吴非07中国药科大学生科基地13655178950gtf_张路阳07中国药科大学生科基地158505773
2、50gtf_伊宁07中国药科大学英语13276660036gtf_申请人或申请团队成 员李响07中国药科大学生物技术15850689938gtf_姓名高向东年龄46单位中国药科大学行政职务/专业技术职务副院长/教授/博导导 师主要成果中国药科大学微生物与生化药学教授（博士生导师） 、生命科学与技 术学院副院长。是国务院学位委员会第六届学科评议组药学组成员，第四 届教育部“高校青年教师奖”获得者，江苏省“六大人才高峰” 培养人 选，主持国家 863 课题、国家自然科学基金项目等多项国家及省部级课题。主要研究方向为生物新药的研究及生物大分子结构与功能研究。在国 内外学术刊物上发表研究论文近百篇，被
3、SCI收录 30 余篇。以主编、 副主编出版著作 4 部，另参加 4 本著作的编写。实现科技成果转化项目多 项，申请发明专利十多项。国家精品课程和江苏省精品课程（生物制药工艺学）的课程负责人 （2008 年） ，获江苏省教学成果二等奖（排名第一，2009 年） ，江苏省教 学成果一等奖（排名第三，2007 年） ，2007 年获“江苏省优秀教育工作者” ，2003 年获第四届教育部“高校青年教师奖” ，同年获得江苏省“三八” 红旗手称号，入选江苏省“333”工程培养人选（2007，2001 年） 、江苏省 “六大人才高峰” 培养人选（2003 年） ，1999 年获江苏省普通高校“红 杉树”园
4、丁奖银奖，2008 年作为指导老师指导学生（团队）完成的项目参 加在美国麻省理工学院举行的“IGEM 国际基因工程机器设计大赛”获得铜 奖。 2一、一、申请理由申请理由（包括自身具备的知识条件、自己的特长、兴趣、已有的实践创新成果等）该小组的成员共有七名成员：三名来自理科基地班，两名来自生科基地班，一名来自生物技术，一名来自英专。组员简介如下：1.周婕：来自 07 级理科基地班，校一等奖学金，三好学生标兵，优秀团干，优秀成绩通过四六级及计算机二级考试。曾参与新药筛选中心创新项目，暑期曾在分子生物学实验室实习。热爱生命科学，具有扎实的理论基础和娴熟的实验操作技能。2.王南溪：来自 07 级理科基
5、地班，校一等奖学金，三好学生标兵，优秀团干，优秀成绩通过四六级及计算机二级考试。曾参与分析教研室多个项目，对生命科学有浓厚兴趣。3.杨辰：来自 07 级理科基地班，校三等奖学金，优异成绩通过四六级及计算机二级考试。热爱生命科学，具有扎实的理论基础和娴熟的实验操作技能。4.吴非 ：来自 07 级生科基地班，校级十佳标兵，计算机技术娴熟，曾参加开放实验。具有扎实的理论基础和娴熟的实验操作技能。5.张禄阳：来自 07 级生科基地班，三等奖学金，校团委助理，优秀共青团干部，英语能力突出。在阅读文献及撰写论文方面具有较强能力。6.伊宁：来自 07 级英语专业，一等奖学金，计算机技术娴熟，擅长英语。具有参
6、加开放实验的经历。对各种知识都有钻研精神，对生物技术浓厚兴趣。7.李响：来自 07 级生物技术专业，三等奖学金，生科院文艺部部长，具有良好的沟通能力和团队协作能力。曾参与开放实验。该小组成员拥有一个共同的特点，就是理论基础扎实，具有一定的实验操作技能，并且热爱生命科学，对本项目有浓厚的兴趣。他们又分别具有各自的优势和特长，如：英语水平高，计算机运用能力强。整个团队通过分工合作，有能力高效、顺利地完成实验项目，达到实验预期效果。3二、二、项目方案项目方案（包括项目的训练目标、前期准备、组织实施、过程管理、实践环节、教师指导、 项目结题等）本项目是国家 863 课题“非天然氨基酸定点改构技术平台的
7、建立及应用”的一个分支，是利用非天然氨基酸定点改构技术平台进行蛋白质构效关系研究的一个应用研究。非天然氨基酸定点改构技术是分子生物学领域近年来发展起来的一项较为前沿的技术。它可以突破 20 种天然氨基酸的限制，表达出带有非天然氨基酸的蛋白质分子，从而将蛋白质的研究带入一个全新的领域。例如：将侧链带有荧光基团的氨基酸定点引入蛋白质中，可以通过荧光检测，在不同条件下研究蛋白质的功能。这一技术对蛋白质构效关系研究和新型药用蛋白分子的设计具有重要意义。绿色荧光蛋白（GFP）是从一种生活在北太平洋寒冷水域的水母体内发现的。GFP 含有一段由三个氨基酸组成的特殊序列：丝氨酸酪氨酸甘氨酸。当蛋白质链折叠时，
8、这段短片段就被深埋在蛋白质内部，然后，发生一系列化学反应：甘氨酸与丝氨酸之间形成化学键，生成一个新的闭合环，随后这个环会自动脱水。最终，经过大约一个小时的反应，周围环境中的的氧气攻击酪氨酸的一个化学键，形成一个新的双键并合成荧光发色团。作为报告基因，GFP 在细胞分子生物学领域有着重要而广泛的用途。为了进一步扩大GFP 的用途，许多科学家都在进行 GFP 分子的改造，以使其发出不同颜色的荧光或产生某些新的功能。如利用改造后 GFP 可以设计新型生理传感器，有研究者设计了一种被修饰过的用来感应锌离子浓度的蓝色荧光蛋白，当红色的锌离子连接到蓝色的被修饰过的发色团上后，蛋白质会发出亮度增强一倍的荧光
9、从而形成容易被检测到的可见信号。2008 年 10月 8 日，日本科学家下村脩、美国科学家马丁查尔菲和钱永健因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年的诺贝尔化学奖。通常改造 GFP 的方法是使发色团产生能改变其稳定性的小的变异，而由于二十种天然氨基酸的限制，对 GFP 发色团的定点突变所获得突变体数量极为有限。而非天然氨基酸定点改构技术恰好可以突破这一限制，使得设计和筛选更多种新型绿色荧光蛋白成为可能。本项目拟采用非天然氨基酸定点改构技术，将其用于绿色荧光蛋白发色基团的改造，并对所获得的含非天然氨基酸的 GFP 进行相关性质研究和构效关系研究，以期获得荧光发射波长不同于天然 GFP 的新型荧光蛋
10、白分子，并通过构效关系研究，为新型 GFP 分子的设计提供理论依据。1.训练目标：训练目标：培养该组学生创新思维能力，团队合作能力，并且使他们提早了解科研的过程，提前参与4科研，养成科学的实验习惯，为他们之后的科研道路奠定基础。具体来说，通过一系列完整的科研活动：文献查阅、方案设计、实验研究、数据处理、研制开发、建立理论模型、综合测试与完善、模型优化和检验、撰写论文及研究报告、结题和答辩，使学生提前了解科研的全过程，参与指导老师的科研，并且自主进行科研。在这个过程中，鼓励学生自主完成每个步骤，组员之间共同商议相关问题，共同克服困难，学会与老师进行有效的沟通。2.前期准备：前期准备：前期准备工作
11、包括：基础知识培训、文献调研、分工安排及材料准备：1、基础知识培训：参与项目研究前，在指导老师的安排下，进行必要的实验技能和相关背景知识的培训，保证对所参与的项目有充分的了解，能独立进行文献调研、实验设计并能独立对实验中需要用到的仪器设备的进行操作。2、文献调研：设计实验方案前，有必要对相关研究的背景及进展情况进行文献调研，充分了解相关研究目前的发展状况，以保证所设计的实验计划具有一定深度和广度，以充分的发挥参与成员创造性能力。3、分工合作鉴于项目组成员只能在课余时间参与项目研究，确定有效的分工合作方式是十分必要的。在项目组织实施前，根据实验设计将具体工作分解为较小的独立任务，每个任务有一个同
12、学主要负责，34 个同学辅助，时间和人员由项目组长组织大家讨论协商决定，确定工作进度表和任务指标。3.组织实施：组织实施：根据文献调研的情况及课题的初步计划，在指导老师的指导下，进行独立的实验设计。项目计划分为两个分支：由项目组长协调安排，将 7 名成员分 2 个小组，三名成员负责对绿色荧光蛋白进行定点突变，并将其连接到所需载体中去。四名成员负责进行酪氨酰 tRNA合成酶基因文库的筛选，寻找能引入不同非天然氨基酸结构的酪氨酰 tRNA 合成酶。最后两组同学合作进行绿色荧光蛋白的表达及性质研究。同时每个成员对他人负责的内容辅助参与，以保证每个成员都既能对课题有全面的了解，又能发挥各自的特长，独立
13、完成一个较小的分支任务。进度安排进度安排5本实验将从 2009 年 5 月开始，于 2010 年 5 月结题，历时一年。2009 年 5 月-2009 年 6 月：组织学生查阅绿色荧光蛋白以及遗传密码扩充技术的相关文献，进一步深入理解本实验所涉及的核心技术遗传密码扩充技术，已经该技术在绿色荧光蛋白改造中的具体应用。2009 年 7 月-2009 年 8 月：组织学生将在本部实验室做本项目的部分工作，主要包括绿色荧光蛋白的定点突变和氨酰 tRNA 合成酶基因文库的筛选工作。学生必须及时修正实验设计，解决可能发生的偶然情况，熟练掌握本实验的操作技能。2009 年 9 月-2010 年 1 月：完成
14、对氨酰 tRNA 合成酶基因文库的筛选，对所获得的 GFP 突变体进行表达。2009 年 2 月-2009 年 5 月：对含有非天然氨基酸的 GFP 进行性质研究。同时将利用业余时间撰写论文及研究报告，准备结题和答辩。4.过程管理：过程管理：（1）任务进行前要有明确的任务计划书，由指导老师审阅同意后进行实施。（2）任务进行过程中要有详尽的实验记录。（3）定期组织进行实验讨论，分析实验结果，进行总结。（4）根据实验结果提出是否修改后续实验计划，如需改动，提交详细的修改计划。（5）任务结束时，每个任务分支都必须提供一份完整的实验报告。（6）结题时提交结题报告、研究成果和研究工作记录。进行结题答辩。
15、5实践环节实践环节根据期文献调研，现拟定初步的实验方案如下：a)GFP 荧光蛋白的定点突变：通过 overlappingPCR 方法，将 GFP 发光基团中的 Tyr66 突变为终止密码子，并将其连接到pACYC 载体中，用于非天然氨基酸的定点引入。b)酪氨酰 tRNA 合成酶突变文库的筛选：将连接有酪氨酰 tRNA 合成酶突变文库基因的质粒 pBR322-TyrLib，与 pACYC-tRNA 共转化至大肠杆菌 DH10B 中，涂于含有不同种类非天然氨基酸和氯霉素的平板上，培养过夜，选取单菌落接种于 M9 培养基中扩培，提取质粒，连接至 T 载体中测序。c)含非天然氨基酸的 GFP 的表达将
16、筛选获得的 pBR322-Tyr 质粒与连接有突变后 GFP 基因的 pACYC-tRNA-GFP 共转化，在 M96培养基中添加相应非天然氨基酸（对氟苯丙氨酸，对硝基苯丙氨酸，对叠氮苯丙氨酸等） ，OD=0.8 时加入 IPTG 诱导 GFP 表达。d）GFP 性质研究1）比较不同非天然氨基酸引入后，GFP 最大激发波长的变化2）比较不同非天然氨基酸引入后，GFP 最大发射波长的变化6. 项目结题：项目结题：项目结束后，提交结题报告、研究成果和研究工作记录，由学校组织结题验收，以答辩和考核指标相结合的方式进行。7三、三、学校提供条件学校提供条件（包括项目开展所需的实验实训情况、配套经费、相关扶持政策等）该项目依托生命科学院生物制药实验室进行；实验室具有以下仪器设备：二氧化碳培养箱、倒置显微镜、PCR 仪、高速冷冻离心
