《血管内皮细胞的培养方案及其药物的应用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血管内皮细胞的培养方案及其药物的应用（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、摘要摘要】 通过乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase， LDH）的检测，观察解毒通络药物干预后的脑微血管内皮细胞条件培养液（ conditioned medium of cerebral microvascular endothelial cells， CMECs-CM）特征及其抗缺血及再灌皮质神经元损伤的效应，探讨脑微血管内皮细胞（cerebral microvascular endothelial cells， CMECs）调控神经元功能的机制。方法:通络救脑注射液（Tongluo Jiunao Injection， TLJNI）作用于正常、缺血和缺血再灌三种培养状态的大
2、鼠 CMECs，分别收集有药物干预及无干预的三对无血清内皮细胞条件培养液，并测定其 LDH 值。同步原代培养大鼠脑皮质神经元，亦分为正常、缺血、缺血再灌三组，用低（10%）、中（50%）、高（100%）三种浓度的各类 CMECs-CM 分别作用上述三种培养状态的神经元，测定其 LDH 漏出率。结果:比较 TLJNI 干预后的 CMECs-CM 与无干预的 CMECs-CM 中 LDH 漏出值，CMECs 缺血组与缺血再灌组经药物干预后均明显降低（ P 0.05）。说明 TLJNI 能够防御 CMECs 缺血及缺血再灌的损伤。见表 1。正常、缺血及缺血再灌组组间比较，缺血组 LDH 漏出最低，缺
3、血组与正常组比较，差异有统计学意义（ P 0.01）;缺血再灌组漏出最高，与缺血组比较，差异有统计学意义（ P 0.01），提示CMECs 缺血及再灌模型基本可靠。缺血组 LDH 漏出最低可能与其 CM 收集的时间有关，因其造模时间是 6 h，故收集的是 6 h 的培养液，而正常及缺血再灌组收集的是 12 h 的条件培养液。见表 1。表 1 TLJNI 干预与未干预的各组 CMECs-CM 的 LDH 释放值比较（略）Table 1 LDH release value of different CMECs-CM* P 0.05， vs CM without drug treatment;P 0
4、.01， vs normal CMECs-CM;P 0.01， vs ischemia CMECs-CM.2.2 不同 CMECs-CM 分别作用不同状态神经元后的 LDH 漏出率 Is-CM 不同浓度作用缺血神经元，与对照组即未做任何处理的缺氧神经元比较，仅表现为 100%的 Is-CM 增加 LDH漏出率（ P 0.01 ）。IsT-CM 作用后表现为 100%的 IsT-CM 增加 LDH 漏出率（ P 0.01），而 10%的 IsT-CM 组 降低 LDH 漏出率（ P 0.05）。不同浓度及组别的 CM 作用规律不一致，可能与所含活性物质不同，或所含活性因子的不同效价有关。见表 2
5、。TLJNI直接干预神经元，与对照组比较，LDH 漏出率却明显增高（ P 0.01），可能与本实验的投药剂量（仅参照 CMECs 的给药方式）偏高有关。若 CMECs-CM 作用 Is 组神经元与药物直接作用组比较，则均表现为 LDH 漏出率降低（ P 0.05 或 P 0.01），提示药物可通过内皮细胞介导发挥抗缺血神经元损伤的作用。见表 2。表 2 CMECs-CM 对缺血神经元 LDH 漏出率的影响（略）Table 2 LDH leakage rate of ischemia neurons intervened by different CMECs-CM*P 0.05，*P 0.01，
6、 vs untreated control group;P 0.05 ，P 0.01， vs drug-treated group.与对照组比较，各类 CMECs-CM 作用缺血再灌组神经元后均能降低神经元 LDH 漏出率（ P 0.05 或 P 0.01），提示各类 CMECs-CM 都存在着抗再灌神经元损伤的活性物质。每种条件液相邻浓度间比较，均以 10%或 50%的 CM 降低损伤为佳，N-CM 及 Rp-CM 组间差异有统计学意义（ P 0.05 或 P 0.01），其余两组浓度间差异不显著，提示不同组间发挥作用的活性物质的不一致性及可能非单一活性物质作用的复杂性。见表 3。表 3 C
7、MECs-CM 对正常组及缺血再灌组神经元 LDH 漏出率的影响（略）Table 3 LDH leakage rates of normal and ischemia/ reperfusion neurons intervened by different CMECs-CM*P 0.05，*P 0.01， vs control without CM group;P 0.05 ，P 0.01， vs the nearest pre-concentration group.各类 CMECs-CM 作用于正常组神经元后均增加了神经元 LDH 漏出率（ P 0.05 或 P 0.01）。每种条件液相邻
8、浓度间比较，N-CM 三组间差异有统计学意义（ P 0.05 或 P 0.01），其余各组差异无统计学意义。见表 3。3 讨论我们从以往的离体实验已知，TLJNI 在缺血状态下具有可靠的维护脑微血管内皮功能的作用4，5，对于改善脑微灌流具有实际意义。这种对 CMECs 的保护作用是否启动进一步的脑保护效应有待探知。目前对中药保护脑缺血损伤的研究，多针对药物能否透过血脑屏障这一关键途径而开展，本实验收集了正常、缺血及解毒通络药物干预的各种无血清内皮细胞条件培养液，试图了解生理及病理状态下可能通过内皮细胞介导的对神经元发挥作用的途径和效应。结果表明对于缺血及再灌这种病理状态下的神经元，各类 CME
9、Cs-CM 都起到了一定的抗损伤效应。理论上假说应是不同类别的条件培养液对神经元的作用机制有着差别，可以预想各类条件培养液中分别蕴含着多种活性物质，我们更感兴趣的是所涉及的功能蛋白质是如何发挥作用。发挥作用的生物活性因子可能是一种或是多种，与条件培养液收集的时段有关。探索其作用机制还要考虑到动态变化诸如激活、失活、协同、拮抗、连锁等诸多因素的影响。本实验仅从细胞的 LDH 漏出率角度即代表着细胞膜损害的一个指标揭示了初步现象，表明 TLJNI 可通过内皮细胞介导发挥抗缺血神经元损伤的作用，提示各类 CMECs-CM 都存在着抗缺血及缺血再灌神经元损伤的活性物质。但该时段的内皮细胞条件培养液对正
10、常神经元却表现为增加了 LDH 漏出率，即一定程度上增加了细胞膜损伤。我们知道脑微血管内皮及其紧密连接是血脑屏障的重要形态学基础，对维持中枢神经系统内环境的稳定具有重要意义。正常情况下，除氧和二氧化碳可以自由通过血脑屏障外，绝大多数物质通过血脑屏障进入中枢神经系统都有其特定的通道。血脑屏障选择性控制脑细胞间液与血液间的物质转运，维持脑细胞间液的平衡，从而保证了神经细胞内环境的稳定。体外研究内皮细胞分泌的活性物质直接作用于神经细胞，暂时忽略了血脑屏障选择性的屏障保护作用，可能是导致正常神经元细胞膜通透性增加的主要原因。但仍为我们进一步深入研究内皮细胞的合成和分泌功能，及其活性物质调节神经细胞功能
11、的作用机制，提供了积极的启示。脑缺血损伤是众多脑系疾病的共同病理过程，阐明疾病的分子和细胞机制及药物作用的靶标，发展寻找新药的新理论、新技术、新方法7，相信会为治疗脑系疾病的中药现代化研究提供新的思路。研究报道内皮细胞具有强大的分泌功能8，探索已知的、未知的、好的、坏的脑微血管内皮细胞的调控机制具有重要意义。就中医而言，以毒邪和络病作为深入研究的切入点，是进一步提高脑血管疾病疗效的突破口所在9。目前，国内外许多学者已注意到微循环局部与整体全过程的联系，提出血管内皮细胞是某些致病因素的靶细胞10，11。我们以 CMECS 为切入点，诠释 TLJNI“解毒通络”的作用机制，探索药物的有效“靶标”分
12、子，对于深化“毒损脑络”病机6理论内涵具有重要意义。【参考参考文献文献】1Gao YH， Yuan ZZ， Niu FL， et al. The protective effect of cholic acid on an in vitro injury model of ischemia-reperfusion in cerebral microvascular endothelial cells. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2005; 30（12）: 930-932. Chinese with abstract in English.高永红， 袁拯忠， 牛福玲，
13、 等. 脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注模型的建立及牛胆酸的保护作用. 中国中药杂志. 2005; 30（12）: 930-932. 2 Xu LR， Ma SB， Li PT， et al. Effects of effective com-ponent from “Qing Kai Ling” on endothelial cell of microvessel in MCAO rats. Zhong Yao Cai. 2004; 27（5）: 348-351. Chinese with abstract in English.徐丽荣， 马世彬， 李澎涛， 等. 清开灵有效组分对 MCAO
14、大鼠脑微血管内皮细胞的影响. 中药材. 2004; 27（5）: 348-351. 3 Wan SY， Li XQ， Zhi YH， et al. Effects of Nao Yi An serum on VEGF protein expression in cultured rat cere-bral microvascular endothelial cell with hypoxia. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 2004; 15（2）: 77-79. Chinese with abstract in English.万赛英， 黎杏群
15、， 智屹惠， 等. 脑溢安对缺氧大鼠脑微血管内皮细胞 VEGF 基因表达的影响. 中药新药与临床药理. 2004; 15（2）: 77-79. 4 Qing XM， Li WH， Hou JC， et al. Effects of Tongluoji-unao injection on the activity of rat cerebral microvascu-lar endothelial cells. Xian Dai Sheng Wu Yi Xue Jin Zhan. 2006; 6（2）: 12， 15-18. Chinese with abstract in English. 青
16、雪梅， 李卫红， 侯金才， 等. 通络救脑注射液对脑微血管内皮细胞活性影响的特征. 现代生物医学进展. 2006; 6（2）: 12， 15-18. 5 Qing XM， Li PT， Hu JH， et al. Observing effects of TLJN injection on the rat cerebral microvascular endo-thelial cells and primary study of the feature of cellular conditioned medium. Xian Dai Sheng Wu Yi Xue Jin Zhan. 2006; 6（4）: 1-4. Chinese with abstract in Eng-lish.青雪梅， 李澎涛， 胡京红， 等. 通络救脑注射液对大鼠脑微血管内皮细胞活性及其条件培养液影响的初步研究. 现代生物医学进展. 2006; 6（4）: 1-4. 6 Li PT，
