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1、基础篇基础篇- -无菌操作基本技术无菌操作基本技术1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射 30-60 分 钟灭菌，以 70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转 10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦 不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出 工作台，以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转 1 0 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器 或吸管盒等可以暂时放置，
2、其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。 实验用品以 70%ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中 央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口 ，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶 身，倾斜约 45角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自 人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至 少 Class II)。操作过程中，应避免引起 aerosol 之产生，小心毒性药品，例
3、如 DMSO 及 TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。中，应避免引起 aerosol 之产 生，小心毒性药品，例如 DMSO 及 TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。5. 定期检测下列项目：CO2 钢瓶之 CO2 压力； CO2 培养箱之 CO2 浓度、温度 、及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）；无菌操作台内之 airf low 压力，定期更换紫外线灯管及 HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，30 00 小时/HEPA)。6.水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。基础篇基础篇- -实验用品实验用品1.1. 种类：种类：1.1. 细胞培养实验用
4、品均为无菌，除了玻璃容器与 pasteur pipet 外，其它 均为塑料无菌制品。1.2. TC 级培养盘表面均有 coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类 有 Tflask，plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有 2 种不同材质，其中 polypropylene ( PP) 为不透明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合 材质之离心管
5、。1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,100 0ml 2.2. 清洗：清洗：2.1. 新购玻璃血清瓶先以 0.10.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水 冲洗干净，勿加清洁剂清洗。3.3. 灭菌：灭菌：3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌 121, 15 lb, 20 分钟，置于 oven 中烘干。3.2. 实验用玻璃 p
6、asteur pipet 以干热灭菌 170, 4 小时。3.3. 液体或是固体废弃物可用 10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高压灭菌 121 , 15 lb, 20 分钟处理。基础篇基础篇-培养基培养基 1. 液体培养基贮存于 4 冰箱，避免光照，实验进行前放在 37 水槽中温热。 2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间 glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量 glutamine。3. 粉末培养基配制(以 1 升为例)：3.1. 细胞培养基通常须添加 10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为 900 ml，pH 为 7.
7、2 - 7.4。NaHCO3 为另外添加，若将 NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成 pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及 NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用 CO2 气体调整 pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的 pH 易发生改变。3.2. 材料：纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要) ，粉末培养基 ，NaHCO3 ，电磁搅拌器 无菌血清瓶 ，0.1 或 0.2 mm 无菌过滤膜 ，pH 计，真空泵，CO2 气体 。3.3. 步骤： 3.3.1. 取粉末培养基溶于 700 ml milli
8、-Q 水中，搅拌使其溶解。3.3.2. 称取适量之 NaHCO3 粉末溶于 200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入 CO2 气体至饱和，约 3-5 分钟。3.3.3. 将溶解且含饱和 CO2 之 NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之 pH 应为7.2-7.4，除非 pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入 CO2 气体调整 pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH 会升高 0.1-0.2。3.3.4. 以 0.1 或 0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于 4。(血清亦可加入培养基中
9、一起过滤) 3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。基础篇基础篇-抗生素抗生素1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素 1.1. 培养自 ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，制作 token freeze 前培养基须添加抗生素，待 token freeze 通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。 2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个 flask 时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。3. 若要检测 mycoplasma，则培养基内不可添加 gentami
10、cin，因 gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。4. 去除细菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。5. 抗生素使用种类与浓度工作浓度储存温度杀灭细菌penicillin100 UI/ml-20G(+) bacteriastreptomycin100 ug/ml-20G(+) and G(-) bacteriachlotetracycline50 ug/ml-20G(+)
11、and G(-) bacteriagentamicin50 ug/ml-20G(+) and G(-) bacteria, mycoplasmaamphotericin B2.5 ug/ml-20yeast and moldsnystatin50 ug/ml-20yeast and moldsfungizone2.5ug/ml-20yeast and molds基础篇基础篇-血清血清 1. 血清必须贮存于20 -70，若存放于 4，请勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可将 4045 ml 分装于无菌 50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约 10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否
12、则易发生污染或容器冻裂之情形。 2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。 3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20或70至 4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以 50 ml 无菌离心管可分装 4045 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由20直接至 37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 4. heat-inactivation 是指 56, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之
13、目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。 5. 勿将血清置于 37太久，若在 37放置太久，血清会
14、变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。6. 血清之沈淀物6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心 3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将
15、血清放在 37中欲培养此“微生物”，但在37环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。 基础篇基础篇-细胞传代培养细胞传代培养 1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为 1:3 至 1:6，依细胞种类而异。2. 材料：2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbeccos phosphate-buffered saline, Ca+/Mg+ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-ED
16、TA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)：以 10 ml 分装于 15 ml 无菌离心管中，保存于20，使用前放在 37 水槽回温。2.3. 新鲜培养基 2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶3. 步骤：3.1. 附着型胞(adherent cell) 3.1.1. 吸掉旧培养液。3.1.2. 用 D-PBS 洗涤细胞一至二次。3.1.3. 加入 trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉 trypsin-EDTA 溶液。(若不移去 trypsin-EDTA，则在 trypsin-EDTA 作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止 trypsin 作用，离心后再吸掉上清液。) 3.1.4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶
