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1、 1生化科技學系微生物學組專題討生化科技學系微生物學組專題討 題目題目: Pivotal Role of the Cyclin-dependent Kinase Inhibitor p21WAF1/CIP1 in Apoptosis and Autophagy. 作者：作者：Keishi Fujiwara, Shigeru Daido, Akitsugu Yamamoto, Ryuji Kobayashi, Tomohisa Yokoyama, Hiroshi Aoki, Eiji Iwado, Naoki Shinojima, Yasuko Kondo, and Seiji Kondo 文章
2、源：文章源：The Journal of Biological Chemistry 283: 388-397, 2008. 演講人：演講人：Ya-Fei Li 亞菲 B93B02002 指導師：指導師：Ching-Tsan Huang, PhD 黃慶璨 博士 演講日期：演講日期：March 25th, 2008 演講地點：演講地點：The 6th classroom 摘要摘要 正常的細胞發展過程中，許多細胞最後會走上非病因性的死亡，此種情況被 稱作計畫性細胞死亡(programmed cell death, PCD)，與許多生現象有關，並有 於細胞回收再用資源；但當其失去控制時，則和癌症或特殊
3、疾病的發生有密 的關係。而 PCD 依其形態與生化性質上的差，可分為細胞凋亡(apoptosis) 與細胞自嗜(autophagy)，者有研究顯示與疾病的產生有所關。越越多證 據顯示，細胞凋亡與細胞自嗜間有相互交(cross-talk)的情況，但對於詳細的分 子機制卻仍存在許多未解的問題。本研究主要目的在探討 p21WAF1/CIP1 此一分 子，在此種 PCD 途徑的交中所扮演的角色。已有研究顯示 p21 可以正或負 調控細胞凋亡，但和細胞自嗜的關性卻清楚。作者使用 p21+/+ 和 p21-/-的 鼠胚胎纖維母細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)為研究對象
4、，並以C2-ceramide 作處，對此種細胞所引發的細胞凋亡或自嗜以探討 p21 的影響。 在確定 C2-ceramide 對細胞生存的影響後，藉由分析細胞週期、DNA 染色與酸 性囊胞器定(Quantification of acidic vesicular organelles)，發現 C2-ceramide 在 p21+/+和 p21-/-的細胞種中分別會引發細胞凋亡與細胞自嗜；為進一步確定 p21 在 PCD 中的影響，作者分別用 siRNA 與外生表現(exogenous expression) 的技術去抑制和大表現於 p21+/+與 p21-/-的細胞，並藉由觀察 GFP-LC3
5、 的小 點分布，發現 p21 的減少會導致自嗜作用的增加，反之則造成凋亡作用的提 升。接著作者進一步比較，抑制與過表現細胞自嗜相關蛋白質 (autophagy-related, Atg) Beclin 1 與 Atg5，證實者也與 C2-ceramide 引起的 PCD。最後再以 射線處細胞，確定以上實驗結果並僅限於 C2-ceramide 引 起的 PCD。綜合以上，作者認為 p21 會正向調控細胞凋亡而負向調控自嗜途徑， 對於決定細胞走向何種途徑扮演重要的腳色。 Keywords：PCD, apoptosis, autophagy, p21, C2-ceramide 2前言前言 ? 本研究
6、之重要性本研究之重要性 PCD是正常生長況下，細胞週期的最終過程，其中至少包括細胞凋亡 與細胞自嗜種途徑。而細胞的死亡由近的研究顯示，和癌症及特定疾病 的發生有很大的關，如癌細胞的滋長可能肇因於受控制的PCD，又如經 退化疾病起因於過盛的自嗜作用(1)；因此，能解PCD的詳細分子機制， 相信對於治上的應用會有相當大的助，因而相關研究也越越受重視。 ? 前人做過的研究前人做過的研究 細胞凋亡與細胞自嗜在正常生態存在，但受控制的況下就可能 引起疾病或癌症(1)。目前有越越多證據顯示，種PCD途徑會有有相互交 (cross-talk)的情況。另外，p21WAF/CIP1被發現除為cyclin-dep
7、endent kinases (CDKs)的抑制劑(4)外，有調控細胞凋亡的功能(3)。 ? 作者為何要做本研究作者為何要做本研究 在前人的研究中，關於種 PCD 途徑相互交的詳細分子機制，以及 與的分子未知；雖然 p21 能調控細胞凋亡，但其在細胞自嗜途徑中所扮演的 角色也尚清楚。因此，作者想知道 p21 是否在此種 PCD 途徑中皆分別有 所影響，甚或與相互交的機制。 ? 本研究欲完成之項目本研究欲完成之項目 用 p21+/+與 p21-/-的鼠胚胎纖維母細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)為模式，先以 C2-ceramide 分別在種細胞分別引起細胞凋亡
8、與細胞自嗜後，接著分別抑制或過表現 p21，以觀察 p21 在種 PCD 中的影響；最後 作者想探討 Beclin 1 和 Atg5 這種自嗜相關基因，在 C2-ceramide 於種細胞 中引發的 PCD 所扮演的角色，因此分別作抑制與過表現看其重要性。另外，作者還想知道是否有 C2-ceramide 以外的機制能引起上述結果，故也對 細胞作 射線的實驗，並觀察細胞走向凋亡或自嗜途徑的趨勢。 材與方法材與方法 ? 細胞株細胞株 p21+/+, p21-/-種MEF細胞以含有10% 胎牛血清, 4 mM麩胺醯胺與100 unit/ml penicillin, 100 g/ml streptam
9、ycin 的 DMEM 培養於 37 5%的二氧化碳 培養箱中。 ? 細胞生存能分析細胞生存能分析(Cell Viability Assay) 細胞先以 2x104/well 種在 96 孔平盤，24 小時後以含有濃 0100 M C2-ceramide 的培養基培養，接著以 WST-1 試劑(Roche Applied Science) 37處 一小時後，測 450 nm 吸光，而未以 C2-ceramide 處的細胞生存能視為 100%。 ? 細胞週期分析細胞週期分析(Cell Cycle Analysis) 3上述有或無以 C2-ceramide 處的細胞以 trypsin 分後，再以
10、70%乙醇固 定並以含有 propidium iodide 的試劑(Roche Applied Science)處，之後經過 式細胞儀(flow cytometry)作細胞螢光激活分析(fluorescent-activated cell sorting, FACS)以分析其 DNA 含。 ? 測定細胞凋亡測定細胞凋亡(Detection of Apoptosis ) 細胞先以 4% paraformaldehyde 固定，並以 1 g/ml Hoechst 33258 染核 15 分鐘之後，以螢光顯微鏡觀察分析染色體聚縮或核斷的情況。 ? 定酸性囊胞器定酸性囊胞器 (Quantificati
11、on of Acidic Vesicular Organelles (AVO) with Acridine Orange Staining) 有或無以 C2-ceramide 的細胞在以 Earles balanced salt solution (Invitrogen) 處後，以 acridine orange 染色，再以 FACS 分析。 ? 評估微管相關蛋白質評估微管相關蛋白質 LC3 的與的與(Assessment of the Involvement of Microtubule-Associated Protein LC3). 對 MEF 細胞進轉染，轉入 GFP-LC3 載體並以
12、 C2-ceramide 處，經 4% formaldehyde 固定後在螢光顯微鏡下觀察螢光表現是否呈現小點(表細胞有 自嗜情況)。 ? Pulse-Chase labeling 待細胞長到 70%滿，每次 pulse treatment 以35Smethionine Promix 處 30 分鐘，接著在特定時間點以含有或沒有 25M C2-ceramide 的 DMEM 培養。接著製備全細胞溶液(total cell lysate) ， 並以 anti-Beclin1 抗體與 protein A sepharose beads 作免疫沉澱。免疫複合體接著以 15% SDS-PAGE 分，並
13、以 autoradiography 觀測。 ? Cyclin-CDK 活性測試活性測試 製備好的細胞溶解液以 anti-p21 抗體與 protein A agarose beads 進免疫沉澱，接著以以 15% SDS-PAGE 分並以 anti-CDK2 與 anti-CDK4 抗體探測。 ? siRNA 抑制p21, Beclin 1, Atg5表現的siRNAs (Dharmacon)序如下： mouse p21 siRNA, 5-AGACCAGCCUGACAGAUUUFIGURE3(515533); mouse Beclin 1 siRNA, 5-GGACAGUUUGGCACAAUC
14、A-3(951969); mouse Atg5 siRNA, 5-ACCGGAAACUCAUGGAAUA-3 (506524) 並包括一 nontargeting siRNA當作control。這些 siRNAs (100 nM)以 DharmaFECT3 (Dharmacon)試劑轉染反應48或72小時。 結果與討結果與討 ? C2-ceramide 對對 p21+/+與與 p21-/-的的 MEF 細胞生存能皆有抑制效果細胞生存能皆有抑制效果 以 C2-ceramide 處的 p21+/+與 p21-/- MEF 皆表現出抑制細胞生存的能 與劑有關，過後者在 C2-ceramide 濃為
15、10, 25 與 50 M 時細胞存活較 前者為高(Fig 1A)。由於在 25 M C2-ceramide 時種細胞的存活能皆下44060%，於是作者選擇此濃進後續實驗。 ? C2-ceramide 可引發可引發 p21+/+ MEFs 的細胞凋亡，在的細胞凋亡，在 p21-/-細胞中卻會細胞中卻會 藉由細胞週期分析與 Hoechst 33258 DNA 染色，發現經過 C2-ceramide 處 的 p21+/+ MEFs，是處於 sub-G1 phase 的細胞(Fig 1B)，或是核斷 與染色體有聚縮情形的細胞比(Fig 1C) ， 及 caspase-3 與 PARP 的解(Fig 1D) 皆有明顯上升情形，相反的，p21-/-細胞卻沒有此種變化；另一方面， Z-VAD-FMK 此種 caspase 抑制劑可使經過 C2-ceramide 處而低的 p21+/+細 胞生存能回升(Fig 1E, F)。這種種結果顯示在 p21+/+而非 p21-/-細胞中， C2-ceramide 會解 caspase-3 與 PARP，而引發細胞凋亡反應。 ? C2-ceramide 可引發可引發 p21-/- MEFs 的細胞自嗜，在的細胞自嗜，在 p21+/+細胞中卻會細胞中卻會 在電子顯微鏡觀察
