《[中学教育]1生化科技学系微生物学组专题讨》由会员分享,可在线阅读,更多相关《[中学教育]1生化科技学系微生物学组专题讨(7页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、 1生化科技學系微生物學組專題討生化科技學系微生物學組專題討 題目題目: Pivotal Role of the Cyclin-dependent Kinase Inhibitor p21WAF1/CIP1 in Apoptosis and Autophagy. 作者:作者:Keishi Fujiwara, Shigeru Daido, Akitsugu Yamamoto, Ryuji Kobayashi, Tomohisa Yokoyama, Hiroshi Aoki, Eiji Iwado, Naoki Shinojima, Yasuko Kondo, and Seiji Kondo 文章
2、源:文章源:The Journal of Biological Chemistry 283: 388-397, 2008. 演講人:演講人:Ya-Fei Li 亞菲 B93B02002 指導師:指導師:Ching-Tsan Huang, PhD 黃慶璨 博士 演講日期:演講日期:March 25th, 2008 演講地點:演講地點:The 6th classroom 摘要摘要 正常的細胞發展過程中,許多細胞最後會走上非病因性的死亡,此種情況被 稱作計畫性細胞死亡(programmed cell death, PCD),與許多生現象有關,並有 於細胞回收再用資源;但當其失去控制時,則和癌症或特殊
3、疾病的發生有密 的關係。而 PCD 依其形態與生化性質上的差,可分為細胞凋亡(apoptosis) 與細胞自嗜(autophagy),者有研究顯示與疾病的產生有所關。越越多證 據顯示,細胞凋亡與細胞自嗜間有相互交(cross-talk)的情況,但對於詳細的分 子機制卻仍存在許多未解的問題。本研究主要目的在探討 p21WAF1/CIP1 此一分 子,在此種 PCD 途徑的交中所扮演的角色。已有研究顯示 p21 可以正或負 調控細胞凋亡,但和細胞自嗜的關性卻清楚。作者使用 p21+/+ 和 p21-/-的 鼠胚胎纖維母細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)為研究對象
4、,並以C2-ceramide 作處,對此種細胞所引發的細胞凋亡或自嗜以探討 p21 的影響。 在確定 C2-ceramide 對細胞生存的影響後,藉由分析細胞週期、DNA 染色與酸 性囊胞器定(Quantification of acidic vesicular organelles),發現 C2-ceramide 在 p21+/+和 p21-/-的細胞種中分別會引發細胞凋亡與細胞自嗜;為進一步確定 p21 在 PCD 中的影響,作者分別用 siRNA 與外生表現(exogenous expression) 的技術去抑制和大表現於 p21+/+與 p21-/-的細胞,並藉由觀察 GFP-LC3
5、 的小 點分布,發現 p21 的減少會導致自嗜作用的增加,反之則造成凋亡作用的提 升。接著作者進一步比較,抑制與過表現細胞自嗜相關蛋白質 (autophagy-related, Atg) Beclin 1 與 Atg5,證實者也與 C2-ceramide 引起的 PCD。最後再以 射線處細胞,確定以上實驗結果並僅限於 C2-ceramide 引 起的 PCD。綜合以上,作者認為 p21 會正向調控細胞凋亡而負向調控自嗜途徑, 對於決定細胞走向何種途徑扮演重要的腳色。 Keywords:PCD, apoptosis, autophagy, p21, C2-ceramide 2前言前言 ? 本研究
6、之重要性本研究之重要性 PCD是正常生長況下,細胞週期的最終過程,其中至少包括細胞凋亡 與細胞自嗜種途徑。而細胞的死亡由近的研究顯示,和癌症及特定疾病 的發生有很大的關,如癌細胞的滋長可能肇因於受控制的PCD,又如經 退化疾病起因於過盛的自嗜作用(1);因此,能解PCD的詳細分子機制, 相信對於治上的應用會有相當大的助,因而相關研究也越越受重視。 ? 前人做過的研究前人做過的研究 細胞凋亡與細胞自嗜在正常生態存在,但受控制的況下就可能 引起疾病或癌症(1)。目前有越越多證據顯示,種PCD途徑會有有相互交 (cross-talk)的情況。另外,p21WAF/CIP1被發現除為cyclin-dep
7、endent kinases (CDKs)的抑制劑(4)外,有調控細胞凋亡的功能(3)。 ? 作者為何要做本研究作者為何要做本研究 在前人的研究中,關於種 PCD 途徑相互交的詳細分子機制,以及 與的分子未知;雖然 p21 能調控細胞凋亡,但其在細胞自嗜途徑中所扮演的 角色也尚清楚。因此,作者想知道 p21 是否在此種 PCD 途徑中皆分別有 所影響,甚或與相互交的機制。 ? 本研究欲完成之項目本研究欲完成之項目 用 p21+/+與 p21-/-的鼠胚胎纖維母細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)為模式,先以 C2-ceramide 分別在種細胞分別引起細胞凋亡
8、與細胞自嗜後,接著分別抑制或過表現 p21,以觀察 p21 在種 PCD 中的影響;最後 作者想探討 Beclin 1 和 Atg5 這種自嗜相關基因,在 C2-ceramide 於種細胞 中引發的 PCD 所扮演的角色,因此分別作抑制與過表現看其重要性。另外,作者還想知道是否有 C2-ceramide 以外的機制能引起上述結果,故也對 細胞作 射線的實驗,並觀察細胞走向凋亡或自嗜途徑的趨勢。 材與方法材與方法 ? 細胞株細胞株 p21+/+, p21-/-種MEF細胞以含有10% 胎牛血清, 4 mM麩胺醯胺與100 unit/ml penicillin, 100 g/ml streptam
9、ycin 的 DMEM 培養於 37 5%的二氧化碳 培養箱中。 ? 細胞生存能分析細胞生存能分析(Cell Viability Assay) 細胞先以 2x104/well 種在 96 孔平盤,24 小時後以含有濃 0100 M C2-ceramide 的培養基培養,接著以 WST-1 試劑(Roche Applied Science) 37處 一小時後,測 450 nm 吸光,而未以 C2-ceramide 處的細胞生存能視為 100%。 ? 細胞週期分析細胞週期分析(Cell Cycle Analysis) 3上述有或無以 C2-ceramide 處的細胞以 trypsin 分後,再以
10、70%乙醇固 定並以含有 propidium iodide 的試劑(Roche Applied Science)處,之後經過 式細胞儀(flow cytometry)作細胞螢光激活分析(fluorescent-activated cell sorting, FACS)以分析其 DNA 含。 ? 測定細胞凋亡測定細胞凋亡(Detection of Apoptosis ) 細胞先以 4% paraformaldehyde 固定,並以 1 g/ml Hoechst 33258 染核 15 分鐘之後,以螢光顯微鏡觀察分析染色體聚縮或核斷的情況。 ? 定酸性囊胞器定酸性囊胞器 (Quantificati
11、on of Acidic Vesicular Organelles (AVO) with Acridine Orange Staining) 有或無以 C2-ceramide 的細胞在以 Earles balanced salt solution (Invitrogen) 處後,以 acridine orange 染色,再以 FACS 分析。 ? 評估微管相關蛋白質評估微管相關蛋白質 LC3 的與的與(Assessment of the Involvement of Microtubule-Associated Protein LC3). 對 MEF 細胞進轉染,轉入 GFP-LC3 載體並以
12、 C2-ceramide 處,經 4% formaldehyde 固定後在螢光顯微鏡下觀察螢光表現是否呈現小點(表細胞有 自嗜情況)。 ? Pulse-Chase labeling 待細胞長到 70%滿,每次 pulse treatment 以35Smethionine Promix 處 30 分鐘,接著在特定時間點以含有或沒有 25M C2-ceramide 的 DMEM 培養。接著製備全細胞溶液(total cell lysate) , 並以 anti-Beclin1 抗體與 protein A sepharose beads 作免疫沉澱。免疫複合體接著以 15% SDS-PAGE 分,並
13、以 autoradiography 觀測。 ? Cyclin-CDK 活性測試活性測試 製備好的細胞溶解液以 anti-p21 抗體與 protein A agarose beads 進免疫沉澱,接著以以 15% SDS-PAGE 分並以 anti-CDK2 與 anti-CDK4 抗體探測。 ? siRNA 抑制p21, Beclin 1, Atg5表現的siRNAs (Dharmacon)序如下: mouse p21 siRNA, 5-AGACCAGCCUGACAGAUUUFIGURE3(515533); mouse Beclin 1 siRNA, 5-GGACAGUUUGGCACAAUC
14、A-3(951969); mouse Atg5 siRNA, 5-ACCGGAAACUCAUGGAAUA-3 (506524) 並包括一 nontargeting siRNA當作control。這些 siRNAs (100 nM)以 DharmaFECT3 (Dharmacon)試劑轉染反應48或72小時。 結果與討結果與討 ? C2-ceramide 對對 p21+/+與與 p21-/-的的 MEF 細胞生存能皆有抑制效果細胞生存能皆有抑制效果 以 C2-ceramide 處的 p21+/+與 p21-/- MEF 皆表現出抑制細胞生存的能 與劑有關,過後者在 C2-ceramide 濃為
15、10, 25 與 50 M 時細胞存活較 前者為高(Fig 1A)。由於在 25 M C2-ceramide 時種細胞的存活能皆下44060%,於是作者選擇此濃進後續實驗。 ? C2-ceramide 可引發可引發 p21+/+ MEFs 的細胞凋亡,在的細胞凋亡,在 p21-/-細胞中卻會細胞中卻會 藉由細胞週期分析與 Hoechst 33258 DNA 染色,發現經過 C2-ceramide 處 的 p21+/+ MEFs,是處於 sub-G1 phase 的細胞(Fig 1B),或是核斷 與染色體有聚縮情形的細胞比(Fig 1C) , 及 caspase-3 與 PARP 的解(Fig 1D) 皆有明顯上升情形,相反的,p21-/-細胞卻沒有此種變化;另一方面, Z-VAD-FMK 此種 caspase 抑制劑可使經過 C2-ceramide 處而低的 p21+/+細 胞生存能回升(Fig 1E, F)。這種種結果顯示在 p21+/+而非 p21-/-細胞中, C2-ceramide 會解 caspase-3 與 PARP,而引發細胞凋亡反應。 ? C2-ceramide 可引發可引發 p21-/- MEFs 的細胞自嗜,在的細胞自嗜,在 p21+/+細胞中卻會細胞中卻會 在電子顯微鏡觀察