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1、实验实验 氨基酸的纸层析法氨基酸的纸层析法一、目的一、目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。二、原理二、原理 以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和 有机溶剂组成。展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流 动相，它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行 法；有上向下移动的，称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断 进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速 率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层 析点。在一定条件下（室温、展层剂的组成、
2、滤纸的质量、PH 值等不变） ，不 同的氨基酸有固定的移动速率（Rf 值） Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动 速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸 旋转 90 度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的 目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯 丙氨酸组成。三、实验仪器三、实验仪器1、 新华滤纸2、 层析缸3、 细线4、 点样管5、 橡皮筋6、 电吹风7、 喷雾器四、实验试剂四、实验试剂 1、混合氨基酸溶
3、液（甘氨酸，苯丙氨酸） ，甘氨酸溶液，苯丙氨酸溶液 2、展层剂：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸馏水=13：3：3：1（v:v） 3、0.5%茚三酮无水丙酮溶液：0.5g 茚三酮溶于 100ml 无水丙酮，贮于 棕色瓶中 五、试验步骤五、试验步骤1、取滤纸剪成 2010 厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在 另一端 23cm 处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点） 。 2、取毛细管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过 5mm,每点一次用吹风机吹干，点 23 次为佳。3、点样后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不 要贴在层析缸璧上，当展层至
4、另一端 12cm 处时，停止展层（大约 23 小时） 。4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱 60）烘 干。5、均匀喷上茚三酮无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。7、量取数值，计算各自的 Rf 值，与表中标准氨基酸 Rf 值比较，确定样品 氨基酸种类。 （书上图谱横着看）六、实验结果六、实验结果 1.标准氨基酸单向上行层析法 定性、定量测定： 将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断 进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速 率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，
5、形成距原点不等的层 析点。 甘氨酸层析点中心到原点的距离：0.4cm 苯丙氨酸层析点中心到原点的距离：3.2cm 原点到溶剂前沿的距离:10.8cm 在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH 值等不变） ，不同 的氨基酸有固定的移动速率（Rf 值） Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 Rf(甘氨酸)= 0.4cm/10.8cm =0.037 Rf(苯丙氨酸)= 3.2cm/10.8cm =0.296实验图像：七、实验分析七、实验分析 由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相 同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸
6、上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。 注意事项： 1. 在原点处点样，样点直径不宜超过 5mm,每点一次用吹风机吹干，点 23 次为佳。防止扩散面积过大，使展层效果不佳或直接影响实验结果。否则分离 不好，并且样品用量大，会造成“拖尾巴”的现象, 防止氨基酸斑点重叠。 2. 注意点样线要高于层析液面。防止点样氨基酸溶解于层析液中。滤纸不 要贴在层析缸璧上。防止滤纸左右两端展层速度过快，影响实验结果。 3. 均匀喷上茚三酮无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。 4取滤纸前，要将手洗净，这是因为手上的汗渍会污染滤纸。并尽可能少 接触滤纸。在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上的氨基酸会 造成滤纸上众多斑点.要将滤纸平放在洁净的滤纸上，不可放在试验台上，以防 止污染。 5.展层结束后，切勿忘记用铅笔描出溶剂前沿。 6.在点样时，不要将毛细管插错了试剂瓶。 7.展层剂接触滤纸时一定要均匀、保持前沿线与滤纸平行。 8.风温度不宜过高，否则斑点变黄。 9.影响 Rf 值的因素有：物质本身的化学结构；展层所用溶剂系统；展层剂 pH 值；苯丙氨酸 层析点甘氨酸层 析点展层时的温度；展层所用滤纸；展层的方向(横向，上行或下行)。
