《CML患者体内CD45ROIFNγPR1特异性CTL的初步研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CML患者体内CD45ROIFNγPR1特异性CTL的初步研究（40页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、杨洋C M L 患者体内C D 4 5 R O + l F N Y + P R l 特异性C T L 的初步研究1C M L 患者体内C D 4 5 R O + I F N y + P R l 特异性C T L的初步研究中文摘要目的：目前除了异基因造血干细胞移植，C M L 缺乏有效的治愈手段，而通过诱导P R l 特异性C T L 杀伤患者体内C M L 细胞的策略为C M L 的治疗提供了新的思路。本实验通过对C M L患者淋巴细胞亚群分析，探讨其淋巴细胞亚群变化与白血病的关系；利用四聚体技术，探究不同治疗方案对患者体内P R l 特异性C T L 的影响，并进一步分析P R l 特异性C
2、 T L 的C D 4 5 R O 及I F N Y 表达与C M L 患者肿瘤负荷、预后之问的关系，探讨P R l C T L 在C M L治疗中的作用，为临床治疗C M L 提供有效的手段。研究对象：C M L 患者。方法：收集6 5 例C M L 患者骨髓或外周血标本，根据临床资料选取1 0 例初诊患者及1 0 例缓解患者进行淋巴细胞亚群分析。将6 5 例C M L 患者标本分离单个核细胞，并对所有标本进行H L A A 2 型别检测，共筛选出阳性标本2 1 例，再收集仍随诊的1 5 例阳性患者，按治疗方案分为羟基脲组( 5 例) 、干扰素治疗组( 3 例) 、格列卫治疗组( 7 例)
3、，利用流式细胞术检测P R l C T L 频率。其后对1 5 例中仍随诊的1 0 例阳性患者进行P R l C T L 的C D 4 5 R O及I F N v 检测。分析不同治疗方案对P R l C T L 频率的影响以及P R l 一C T L 频率、记忆性( C D 4 5 R O 表达) 、活化程度( I F N 吖表达) 与肿瘤负荷( B C R - A B L 拷贝数) 之间的关系。结果：1 、初诊组样本的C D 8 + T 淋巴细胞( 2 5 6 2 + 4 9 3 ) 明显低于缓解组( 4 1 7 1 4 - 2 3 7 ) ( p 0 0 5 ) 。2 、干扰素治疗组、格列
4、卫治疗组P R l 一C T L s 频率( 分别为0 1 1 6 7 0 0 2 5 ，0 1 3 2 9 + 0 0 2 9 )与羟基脲组( 0 0 1 2 + 0 0 1 8 ) 比较有明显增高( p 0 0 5 ) 2 T h eP R l 一C T Lf r e q u e n c i e so fI F Ng r o u p ( 0 116 7 士0 0 2 5 ) a n dG l i v e cg r o u p ( 0 13 2 9 土0 0 2 9 )w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to ft
5、h eH ug r o u p ( 0 0 1 2 士0 0 18 ) 0 0 5 ) T h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tb e t w e e nP R l 一C T Lf r e q u e n c ya n dS o k a lw a s ( r ) 一0 8 9 2 ，p 0 0 5 ) 。见表2 。表22 组样本淋巴亚群的检测结果比较( - 士s )4 讨论细胞免疫功能缺陷，免疫监视不力是血液肿瘤形成的一大原因，大多数血液肿瘤患者T 细胞的数量减少。本实验采用流式细胞术检测，结果显示1 0 例初诊的C M L 患者C D 8
6、 + T淋巴细胞明显低于缓解组，C D 4 + C D 8 + 比值明显高于缓解组，差异具有显著性意义( p 1 2 ) 、中危( S o k a l 积分0 8 1 2 ) 、低危( S o k a l 积分 0 8 ) 三级。治疗后的S o k a l 积分是根据患者接受治疗后，检测P R l C T L 细胞频率留样本时间的相关指标计算得出的结果。2 表中原始细胞数、血小板、白细胞、脾脏大小染色体及融合基冈为对应检测P R I C T L 留样本时的检测结果。2 3 2 实验分组按治疗方案将1 5 例患者分为以下3 组：( 1 ) 羟基脲组( 5 例)( 2 ) 干扰素治疗组( 3 例)
7、( 3 ) 格列卫治疗组( 7 例) 。扬州大学硕士学位论文1 62 3 3 操作步骤1 ) 用淋巴细胞分离液分离所收集样本的单个核细胞，在3 8 “ C 温水中迅速溶解冻存的已分离的细胞。2 ) 将计数后的P B M C s 转移至E p 管中，每管1 0 6 个细胞。3 ) 清洗：6 0 0 9 ，离心5m i n ，去掉上清，1 0 0 9 l P B S 重悬。4 ) 标记抗体：未做标记的单个核细胞、单标a n t i C D 8 一F I T C m A b 的样本作为背景对照。其余双标管每管样本先分别标记1 嵋P E P R l 一H L A A + 0 2 0 1 四聚体( 终浓
8、度1 0g g m 1 ) ，室温避光孵育3 0m i n ，P B S 洗1 次，然后再分别加入2g la n t i C D 8 一A P C m A b ，4 。C 避光孵育3 0m i n 。5 ) 在6 0 0g 转速下，离心5m i n ，去掉上清，加P B S 充分洗涤2 遍，用3 0 0l x lP B S 重悬细胞。6 ) 流式细胞仪检测：将待测淋巴细胞群设门。依次检测阴性对照管、未标管、单标管，调整参数，然后检测样本P R l C T L 细胞。7 ) 通过F A C SD i v a 软件分析结果。2 4 数据处理及统计学方法所有计算及相关性分析均在S P S S l 6
9、 0 及E x c e l 2 0 0 3 软件中完成，分析数据以均数士标准差( m e a n + S D ) 表示。不同治疗组之间P R l 特异性C T L s 细胞频率比较用单因素方差分析处理，检验水准取= 0 0 5 。3 结果3 1H L A A * 0 2 0 1 阳性C M L 患者比例共检测6 5 例C M L 患者，年龄1 8 7 2 岁。经流式细胞仪检测，H L A A * 0 2 0 1 阳性患者2 1 例占3 2 3 1 ，其中男性1 1 例，女性1 0 例。3 2C M L 患者治疗后体内P R l C T L s 增高研究发现，经过治疗的C M L 患者的P R
10、l 一C T L s 频率均升高，干扰素治疗组，格列卫治疗组P R l C T L s 频率( 分别为0 11 6 7 + 0 0 2 5 ，O 1 3 2 9 + 0 0 2 9 ) 与羟基脲组比较P R l C T L s 频率( O 0 1 2 + 0 0 1 8 ) 有明显增高，且有统计学意义( p 0 0 5 ) ；格列卫治疗组与干扰素治疗组无显著统计学差异( 矿0 3 7 2 ) 。结果见表4 及图1 。杨洋C M L 患者体内C D 4 5 R O + I F N Y + P R l 特异性C T L 的初步研究1 7表4H L A A 2 阳性患者P R l 特异性C T L
11、s 频率与S o k a l 积分0 1；若 - 4 聂0 1舷。# _ ，：w * H H 三! M “H 目M 0 _ I f 。蚓# ： # j t # i w j t t W图1 ：H L A A 2 阳性患者P R l 特异性C T L s 频率直条图3 3C M L 患者P R l C T L s 频率与预后积分负相关C M L 患者P R l 一C T L s 频率与相同时间对应的S o k a l 积分数据见表4 ，相关性分析散点见图2 ：扬州大学硕士学位论文图2P R l C T L s 频率与S o k a l 积分相关性分析散点图1 8经相关性分析，C M L 患者P R
12、 I C T L s 频率与S o k a l 积分的相关系数( r ) 一0 8 7 4 ( r 绝对值愈接近1 关系愈密切) ，盼0 0 0 0 ，p 0 0 1 ，有显著性意义，可以认为P R l C T L s 频率与S o k a l 积分有线性相关关系。P R l C T L s 频率越高，S o k a l 积分值越低，即预后越好。4 讨论H L A 分子是具有高度多态性的人类M H CI 类分子，各种等位基因在人群中的分布不一，H L A A * 0 2 0 1 是所有种族中的最高频等位基因，在中国人中约有4 8 2 的人具有该等位基N t l 9 1 。我国南北方汉族群体H
13、L A A 2 基因亚型种类较多，频率较为分散，但A * 0 2 0 1阳性率达4 5 2 0 1 。我们研究检测的C M L 患者中H L A - A * 0 2 0 1 阳性率为3 2 3 1 。该亚型与C M L 之间有无利害关系尚需进一步研究。慢性髓性白血病是一种缓慢进展的恶性增生性疾病，在该疾病发展中发生一系列针对肿瘤细胞的免疫反应。现阶段，C M L 的免疫治疗已经成为热点，不仅仅是过继免疫治疗取得了很大的进展 2 1 - 2 2 】，而且，格列卫联合干扰素或其他化疗方案治疗C M L 也取得了进剧2 3 。2 印。在以往S h r e y aK a n o d i a 等1 8
14、1 研究中，已发现在新诊断的C M L 患者和对I F N 无反应的患者体内检测不到P R l 一C T L ，而干扰素治疗敏感的C M L 患者体内出现大量P R I C T L 。而且存在一群P R l 特异性的、具有自我更新能力的C D 8 + 记忆C T L 细胞。表明I F N 旺能够诱导C M L 一特异性P R l 一C T L ，重建C M L 患者的免疫功能。C M L 特异性P R l 一C T L 细胞在I F N 停药后仍存在于C M L 患者体内，通过长期的自我更新机制，监视肿瘤相关抗原，清杨洋C M L 患者体内C D 4 5 R O + I F N Y + P R
15、 I 特异性C T L 的初步研究1 9除肿瘤细胞，维持缓解。我们对1 5 例未治疗、干扰素治疗及格列卫治疗的C M L 患者体内P R l 一C T L 细胞进行检测，发现未治疗的C M L 患者体内基本不存在P R l 一C T L 细胞，这与S h r e y aK a n o d i a 等的研究一致。而干扰素和格列卫治疗的患者体内均有一定水平的P R l 。C T L s 。首先，这一结果表明，发病的C M L 患者免疫功能低下，与发病可能直接相关，P R l C T L s 在C M L 患者的免疫监视功能中具有重要作用，经过治疗的患者均达到了一定水平的缓解，体内免疫状态有所提高。
16、但干扰素组与格列卫组并没有显著差异，我们的研究结果并不支持先前有研究提出的格列卫削弱抗白血病免疫性的观点。格列卫的免疫调节影响是近年来争论的焦点，可以解释这些不一致观点的一个可能理由是，很多研究是在体外进行的，应用的格列卫的剂量可能远远大于体内所达到的血浆药物水平。另外，我们对C M L 患者P R l C T L s 频率与对应的S o k a l 积分进行了相关性分析，发现两者呈负相关，P R l C T L s 频率越高，S o k a l 积分越低，即患者的预后越好。这也提示了P R l C T L s 在C M L 患者体内有重要作用，影响预后。总之，用己知白血病抗原制备疫苗促进免疫应答结合格列卫的策略，或者格列卫治疗后用I F N 维持的策略，是临床治疗C M L 患者的新方法，可能会增强患者的治疗
