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1、1前前 言言随着我国养禽业的迅速发展，新的疫病不断出现，发病几率也逐年提高，并且混合感染和疾病的非典型化越来越多，随之禽病诊断遇到的新问题也越来越多，传统的模糊诊断已不能满足生产需要，疾病的确诊最后还要依靠实验室检验。为此，编者在多位专家的指导下，广泛听取基层工作者的意见，并参阅国内外相关材料，结合多年的经验总结，编写了这本规模化禽场禽病实验室诊断技术。全书共十一章。其中第一章至第六章，为禽病实验室诊断技术，包括实验室工作基本技术、培养基的制备技术、细菌的分离培养及鉴定技术、抗菌药物的敏感性及消毒药的筛选试验；第七章至第十章为家禽常见病的实验室诊断，包括常见细菌性疾病的实验室诊断、病毒性疾病的
2、实验室诊断、其他微生物性病的实验室诊断和寄生虫病的实验室诊断；第十一章为饲料及饮水中微生物的检测。编写本书旨在阐述诊断禽病的实验室基本操作技术，满足禽病工作者、实验室检验工作者，尤其是现代化养禽场禽病实验室检验工作者的需要。由于时间仓促，编者水平有限，定有不足之处，恳请批评指正，以便修订。2第一章 规模化禽场实验室的基本条件和工作技术第一节第一节 实验室的基本条件与结构实验室的基本条件与结构一、基本条件禽病检验室通常包括实验室和无菌室（包括无菌室外的缓冲间） 。这样划分并不是绝对的，可根据具体条件而定，但以下几个方面的条件是不可缺少的。对各室的共同要求是高度的清洁卫生，也就是要尽可能地创造无菌
3、条件。为了达到这个目的，房屋的墙壁和地板、使用的各种家具都要符合便于清洗的要求。另外，检验室必须具备保证显微镜工作、微生物分离培养工作及基本化学工作顺利进行的基本条件。如：（1）光线明亮，但避免阳光直射室内；（2）洁净无菌，地面与四壁平滑，便于清洁和消毒；（3）空气清新，应有防风、防尘设备；（4）要有安全、适宜的电源和充足的水源；（5）具备整洁、稳固、适用的实验台，台面最好有耐酸碱、防腐蚀的黑胶板；（6）显微镜及实验室常用的工具、药品应设有相应的存放橱柜。二、无菌室的结构与要求（一）无菌室的结构无菌室通常包括缓冲间和工作间两大部分。为了便于无菌处理，无菌室的面积和容积不宜过大，以适宜操作为准，
4、一般可为 912m2。缓冲间与工作间二者的比例可为1：2高度 2.5m 左右为适宜。工作间内设有固定的工作台、紫外线灯、空气过滤装置及通风装置；较为理想的应有空调设备、空气净化装置，以便在进行微生物操作时切实达到无尘无菌。工作间的内门与缓冲间的门力求迂回，避免直接相通，减少无菌室内的空气对流，以便保持工作间的无菌条件。窗户应装有两层玻璃，以防外界的微生物进入。（二）无菌室的要求（1）无菌室内墙壁光滑，应尽量避免死角，以便于洗刷消毒。（2）应保持密封、防尘、清洁、干燥。（3）室内设备简单，禁止放置杂物。（4）工作台、地面和墙壁可用新洁尔灭或过氧乙酸溶液撩洗消毒。（5）杀菌前做好一切准备工作，然后
5、用紫外线杀菌灯进行空气消毒。开灯照射 30min后关灯，间隔 30min 后方可进入室内工作。（6）无菌室的大小，应按每个操作人员占用面积不少于 3 m2设置。（三）无菌室无菌程度的测定一般采用平板法：将已灭菌的营养琼脂培养基分别倒入已灭过菌的培养皿内，每皿约315mL 培养基，启开皿盖暴露于无菌室内的不同地方，10min 后，盖好皿盖。将培养皿倒置于 37培养箱内培养 24h 后，观察菌落情况，统计菌落数。如果每个皿内菌落不超过 4 个，则可以认为无菌程度良好，若菌落数很多，则应对无菌室进步灭菌。第二节 实验室的工作守则实验室检验是一项精确、细致、耐心的工作，作为禽病诊断检验室的工作人员，在
6、工作过程中既要遵守实验室的规则，防止污染，同时又必须注意安全，防止被病原微生物感染。在开展检验工作时，应该注意下列事项：1. 进入实验室应穿着工作服，进入无菌室应戴口罩、帽子，换专用鞋。2. 实验室内要保持安静、有秩序，不要高声谈笑，影响实验。不准吸烟、饮食和会客。3. 病料检验要体现快而准的原则，采集或接到病料时应及时进行检查和病原分离培养。4. 实验室应保持整洁和卫生。样品检验完毕后及时清理桌面，凡是要丢弃的培养物应经高压灭菌后处理，污染的玻璃仪器高压灭菌后再洗刷干净。器械使用后及时清洗干净并归纳整理，需要灭菌的器械应及时灭菌。药品和试剂使用后放回原处，有毒和腐蚀性大的药剂残液应妥善处理，
7、不得污染环境。5 . 实验室内应备有镊子、剪刀、接种针、接种环等，每次使用前和使用后应在酒精灯火焰上烧灼灭菌。6. 实验室内应备有盛放 3来苏尔或 5石炭酸溶液的玻璃缸，内浸纱布数块；备有75酒精棉球，用于样品表面消毒及意外污染消毒，无菌室每次使用前后，用紫外线灯照射。7. 当致病性病原微生物材料污染台面、地面、衣着和器械时，应立即用 3%的来苏尔或 5%的石炭酸液消毒。如手指或皮肤被污染，应立即用 0.1%的新洁尔灭或 0.05%的百毒杀液洗涤，或用碘酒、酒精棉球搽拭。8. 实验完毕，整理桌面，两手应用肥皂水洗净，必要时先用消毒液（0.1%的新洁尔灭或 0.05%的百毒杀）消毒，然后用清水冲
8、洗。9. 各种贵重仪器平时按要求保管好，加盖防尘和避光罩，使用时应严格遵守操作规程，使用完毕擦洗后放回原处。10. 各种试剂必须贴牢标签，写明品名、规格、配制时间和使用有效期，有秩序的按规定保存。11. 诊断液等生物制剂应先登记，按说明要求的温度放入冰箱或储藏箱（柜） ，注意有效期及效价变化，保证试剂结果准确无误。12. 实验室要定期进行消毒。消毒液可选择 3%的来苏尔、5%的石炭酸、0.5%过氧乙4酸以及 0.05%的百毒杀等。13. 废品、污物和污水放入指定的污物桶内妥善处理，不得随意乱扔。14. 对操作和观察结果应详细记录，注明检验员姓名和日期，以便查核。15. 注意安全。实验室最易发生
9、着火、漏水及触电事故，工作人员应本着认真负责的态度，注意物品（特别是易燃、易爆药品）的存放，节约用电。离开实验室时应对自来水、电源、门窗检查一遍，认为妥善后方可离去。16. 几种意外情况的处理皮肤破伤：先除尽异物，用蒸馏水或生理盐水洗净后，涂以 2碘酒。灼烧伤：涂以凡士林油、5的鞣酸或 2的苦味酸。化学药品腐蚀伤：若为强酸腐蚀，先用大量清水冲洗后，再用 50gL 碳酸氢钠或氢氧化铵溶液洗涤中和之；若为强碱腐蚀，先用大量清水冲洗后，再用 5醋酸或 5硼酸溶液洗涤中和之。第三节 禽病诊断实验室常用的器材和药品一、常用的器材禽病诊断实验室常用的器材列表如下（表 1-1表 1-4） 。各实验室可根据自
10、身的人力、财力条件及工作范围适当增减。表 1-1 仪器类品名数量品名数量电热恒温培养箱1恒温磁力搅拌器1电热鼓风干燥箱1电动离心机1电冰箱2微量振荡器1电冰柜1药用天平1生物显微镜1分析天平1倒置显微镜1超净工作台1高压消毒锅1恒温水浴锅1蒸馏水器1酶标仪1组织捣碎机1超声波清洗机1二氧化碳培养箱1酸度计1切片机1电泳仪1表 1-2 一般器械类品名数量品名数量5移液器3菌落计数器196 孔 V 型塑料板6石棉网2带盖搪磁盘4血球计数板2解剖剪（14cm，尖头）4酒精灯3眼科剪4三角架3长镊子（22 cm）2抽滤瓶1有齿镊子（13 cm）4试管架5无齿镊子（13 cm）4接种棒5眼科镊子4电炉（
11、2000W）2磅秤1试管刷（大、中、小）各 5 把乳钵4 套铝锅1吸耳球5铂金丝或镍铬丝1 包注射器（1ml）30针头（5#）1 盒注射器（5ml）30针头（6#）1 盒注射器（10ml）30针头（8#）1 盒注射器（20ml）30针头（9#）1 盒表 1-3 玻璃器皿类品名数量品名数量试管（10cm1cm）50细颈磨口试剂瓶（白色，100mL）20试管（16cm1.6cm）50细颈磨口试剂瓶（白色，250mL）10试管（20cm3cm）50细颈磨口试剂瓶（白色，500mL）10有刻度离心管（10mL）20细颈磨口试剂瓶（棕色，100mL）20吸管（10mL，0.1mL 刻度）20细颈磨口试剂
12、瓶（棕色，250mL）10吸管（5mL，0.1mL 刻度）20细颈磨口试剂瓶（棕色，500mL）10吸管（1mL，0.01mL 刻度）20玻璃漏斗（直径 6cm）5培养皿(直径 9cm )80玻璃漏斗（直径 15cm）5三角瓶（50mL）各 20三角抽气瓶（500mL）3三角瓶（100mL）20玻璃棒10三角瓶（500mL）20凹玻片1 盒烧杯（100 mL）20载玻片（7.52.3）2 盒烧杯（500mL）20盖玻片（2.02.0）2 盒烧杯（1000mL）20染色缸26量筒（10 mL，250 mL，500 mL）10染色滴瓶（棕色，30mL）10量筒（100 mL）10染色滴瓶（白色，3
13、0mL）10量筒（250 mL）10细胞培养瓶（25 mL）50量筒（500mL）10细胞培养瓶（100 mL）20细颈磨口玻璃下口瓶（5000mL）1温度计5糖发酵用小玻璃管50玻璃珠50表 1-4 杂物类品名数量品名数量胶头滴管10 个乳胶手套5 个药匙10 个脱脂棉1 卷乳胶手套5 个普通棉花适量滤纸5 张纱布1 卷洗脸盆1 个牛皮纸适量配电盘2 个线绳适量洗衣粉2 袋拭镜纸适量工作服4 件牛皮纸适量口罩10 个记号笔5 个水桶1 个精密 pH 试纸2 本二、常用的药品禽病诊断实验室常用的药品列表如下（表 1-5表 1-6） 。根据工作范围可适当增减。表 1-5 糖类、染料和指示剂品名数
14、量品名数量果糖25g结晶紫50g乳糖500g伊红25g葡萄糖500g酸性复红25g麦芽糖500g碱性复红50g甘露醇500g姬姆萨染料25g可溶性淀粉500g瑞士染料50g蔗糖500g亚甲蓝25g石蕊10g酚酞10g甲基红25g酚红10g7中性红10g溴甲酚紫10g溴麝香草酚蓝10g亮绿10g麝香草酚蓝10g孔雀绿10g表 1-6 一般化学药品品名数量品名数量95乙醇2000mL氯化钠500g无水乙醇500 mL过氧化氢500mL乙醚500 mL石炭酸500g醋酸铅100g升汞500g甲醇500 mL柠檬酸500g甲醛500 mL柠檬酸钠500g硫酸1000 mL盐酸500mL硫酸铵500g乳
15、酸500mL硫酸镁500g蛋白胨500g硫酸铜500g甘油500mL硫酸亚铁500g液体石蜡500mL硫代硫酸钠500g固体石蜡500g硫柳汞50g琼脂3000g磷酸二氢钾500g琼脂糖100g磷酸氢二钾500g凡士林500g磷酸二氢钠500g丙酮500mL磷酸氢二钠500g牛肉膏500g磷酸钙500g碘片500g硫酸钾500g碘化钾500g碳酸钠500g氯化钾500 g氢氧化钾500g香柏油50mL氢氧化钠500g二甲苯500mL高锰酸钾500 g重铬酸钾500 g8第四节 常用仪器的使用与保养仪器设备是完成各项诊断工作必备的基本条件之一，仪器的稳定性、安全性及紧密度会直接影响实验结果的准确
16、性和重复性。因此合理的使用和保养仪器是实验室工作人员必须具备的基本技能之一。一、普通生物显微镜（一）显微镜的主要构造 普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。 1.机械部分 （1）镜座：显微镜的底座，用以支持整个镜体。（2）镜柱：镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。（3）镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。 （4）镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。（5）物镜转换器（旋转器）：可自由转动，盘上有 3-4 个圆孔，是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。 （6）镜台（载物台）：在镜筒下方，用以放置玻片标本，中央有一通光孔，我们所用的显微镜其载物台上装有玻片标本推进器（推片器） ，推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，载物台下有推进器调节轮，可使玻片标本作左右、前后方向的移动。 （7）调节器：调节时使载物台或镜筒作上下方向的移动。 粗调节器（粗螺旋）：大
