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1、产超广谱产超广谱 内酰胺酶内酰胺酶 细菌的研究近况细菌的研究近况国外医学临床生物化学与检验学分册 1999 年第 20 卷第 1期解放军总医院微生物科（北京 100853） 沈定霞 周贵民综述摘要 超广谱 内酰胺酶是近年来发现的对三代头孢类抗生素耐药的主要原因。本文从 ESBLs 的类型和作用、产 ESBLs细菌的种类、临床检测、对抗生素的敏感性及医院感染暴发流行的关系诸方面进行了综述。对理解细菌对头孢类抗生素的耐药机制，正确选择抗生素进行治疗以及控制医院产 ESBLs 细菌引起的暴发感染等均有重要意义。关键词：细胞；超广谱 内酰胺酶；抗生素 内酰胺酶是细菌最常产生的、能水解 内酰胺类抗生素的
2、一种酶，是细菌对 内酰胺类抗生素产生耐药性的主要原因。随着三代头孢菌素的问世及在临床上日益广泛的应用，出现了对这些新一代 内酰胺类药物耐药的细菌。导致细菌对此类药物耐药的主要原因是细菌染色体或质粒介导的超广谱 内酰胺酶（extended spectrum lactamases, ESBLs）的产生。目前产 ESBLs 细菌在临床标本中的分离率有增加趋势，由其引起的医院暴发感染也时有报道1，3。故弄清产 ESBLs 细菌的种类，建立其检测方法，了解产 ESBLs 细菌在医院的流行，对理解细菌的耐药机制，选择适当抗生素进行治疗以及探索新药研制途径等均有重要意义，现就这方面的研究近况综述如下。1 E
3、SBLs 的类型和作用根据来源的不同，ESBLs 分染色体介导产生和质粒介导产生两大类。质粒介导产生的 ESBLs 的主要类型是 TEM 类和 EHV类酶，它们分别由 内酰胺酶 TEM-1、TEM-2 和 SHV-1 基因发生单个点突变或多个点突变，从而导致 1 个或多个氨基酸改变而来。迄今为止，TEM 类 ESBLs 由 TEM-3 增加到 TEM-46，SHV类 ESBLs 也由 SHV-2 增加到 SHV-124。附表列出了几种常见TEM 类和 SHV 类 ESBLs 的氨基酸改变。临床实验室还在不断发现新的 TEM 类和 SHV 类 ESBLs。tEM 类和 SHV 类酶具有相同的生物
4、学活性，即水解 内酰胺类抗生素如青霉素和头孢类抗生素，TEM 类和 SHV 类 ESBLs的作用底物更广，已扩大到三代头孢类抗生素和氨曲南。TEM类 ESBLs 在大肠杆菌中较多见，而 SHV 类 ESBLs 在肺炎克雷伯菌中较多见。这两种类型的酶通常可被酶抑制剂棒酸等所抑制。染色体介导的 ESBLs 主要有 AmpC 类，存在于大肠杆菌中，具有AmpC 基因来源的 MIP-1 主要见于肺炎克雷伯菌，他们能水解头霉素，但耐受酶抑制剂的作用。另有一少见 ESBLs 类型为对酶抑制剂耐药的 TEM 类 内酰胺酶（inhibitor-resistant tEM-lactamases, iRT） 。I
5、RT 对酶抑制剂耐受的原因是由于其与 内酰胺酶活性部位相邻的 67 位的甲硫氨酸被其它氨基酸取代，从而降低了对酶抑制剂的亲和力所致。2 产 ESBLs 细菌的种类1983 年德国学者首先发现对广谱头孢菌素耐药的肺炎克雷伯菌5，之后，法国、美国、意大利、中国香港等许多国家和地区相继报道了产 ESBLs 细菌的出现68。一般说来，ESBLs多由肠杆菌科细菌产生，其中以肺炎克雷伯菌及大肠杆菌为主，其次是产气肠杆菌、粘质沙雷菌，并可见于产酸克雷伯菌、弗劳地枸橼酸杆菌、阴沟肠杆菌和肠炎沙门菌等911。由于三代头孢类药物在医院和社区的广泛使用，在药物选择性压力影响下，势必产生相应耐药菌侏甚至新的耐药菌种，
6、临床微生物实验室应重视对这类耐药菌的检测，才能了解其流行趋势，从而指导临床合理应用抗生素。3 产 ESBLs 细菌的检测由于许多产 ESBLs 的细菌对常用检测 ESBLs 的药物如头孢噻肟和头孢三嗪敏感，故仅根据常规细菌药敏试验的结果判定标准不能正确检出产 ESBLs 的细菌，而必须采用特殊的试验方法。现将几种用于检测细菌 ESBLs 的方法简述如下。3.1 双纸片协同试验（double disk synergy test, DDS） 此试验是由法国研究者 Jarlier 等建立的12。其原理是产TEM 类和 SHV 类 ESBLs 对三代头孢类药物如头孢他啶耐药，但能被酶抑制剂如棒酸所抑制
7、，故做纸片法药敏试验时将单纯三代头孢类药及其含酶抑制物的联合剂的两种纸片以适当距离贴放，在两种纸片各自产生的抑菌圈间另产生一抑菌圈，3 个抑菌圈相连形似葫芦状。此法简便，成本低，对产 ESBLs 细菌的检出率为 98.1%13，但只能检测 TEM-12 以外的 TEM 类和 SHV类的 ESBLs，不能检测 AmpC 类 ESBLs14，而且，两种纸片间距离对结果影响很大，当受试纸片本身抑菌圈大时，两纸片间的距离应适当增加，反之亦然。有时为了选择最佳距离，需要进行几次调整。3.2 三维试验（three dimensional test） 由 Thomason和 Sander 创立15，较双纸片
8、协同试验结果可靠，但操作较繁琐。不能常规应用于临床微生物实验室。3.3 E-test 采用 AB bIODISC 公司生产的一端含头孢他啶另一端含头孢他啶及棒酸的试条，通过测定两者 MIC 值进行判断。如待检菌对头孢他啶耐药或头孢他啶与头孢他啶+克拉维酸的 MIC 值之比16o eSBLs 阳性，4 为阴性，8 为可疑14。此法操作简便，结果准确，但有时棒酸从试条扩散致使对侧的抑菌环变形，MIC 值不能读取，此时应另外单独检测头孢他啶的 MIC 值。3.4 Vitek 机器鉴定 采用法国 Biomeriux 的 Vitek 机器及其药敏卡，通过测定 Cefotaxime 和头孢他啶及他们与酶抑
9、制剂棒酸的联合制剂对待检菌的抑制作用而进行测定13，当含棒酸的联合制剂与单纯头孢三代类药物比较，前者使细菌生长受到明显抑制为 ESBLs 阳性。此法需用 Vitek 机器及相应的药敏卡，对产 ESBLs 细菌的检出率为 99.5%13。在检出产 ESBLs 细菌基础上，根据 ESBLs 的等电点差异可行等电聚焦电泳或根据其核苷酸序列设计引物进行 PCR 及序列测定，可进一步确定 ESBLs 的类型。目前尚无令人满意的统一方法用于产 ESBLs 细菌的检测，由于细菌携带 ESBLs 质粒的可传递性，能使耐药菌在医院内蔓延扩散。故有必要尽快建立标准方法检测产 ESBLs 细菌，以帮助临床医生对这类
10、细菌感染病人进行治疗和管理。4 产 ESBLs 细菌与医院感染暴发流行已有多起关于产 ESBLs 细菌引起医院感染暴发流行的报告2，3，16，17，多数引起暴发流行的产 ESBLs 细菌分离自重症监护病房、儿科病房及肿瘤科病房，产 ESBLs 细菌所致的感染暴发流行的发生与病人较多使用三代头孢类抗生素及全身抵抗力减低有关。而且由于 ESBLs 可由质粒携带，很容易在细菌间传递扩散，导致地抗生素耐药细菌的广泛传播，因此，尽管检出产 ESBLs 细菌，有助于控制此类耐药菌及其耐药质粒的传播。5 产 ESBLs 细菌感染与临床抗生素的选用产 ESBLs 细菌对三代头孢类药物均耐药，即使个别三代头孢类
11、抗生素的体外药敏试验结果敏感，但体内效果不佳，不宜使用。另外由于携带 ESBLs 的质粒上可同时携带对氨基糖甙类和喹诺酮类等多种药物耐药的基因，故产 ESBLs 细菌可同时表现出对这两类药物的耐受。对除 IRT 类以外的 TEM 类和 SHV 类产 ESBLs 细菌引起的感染，可使用含有 -内酰胺类抑制剂的联合制剂，如阿莫西林+棒酸；氧哌嗪青霉素+他唑巴坦等。有作者指出在治疗 SHV 类 ESBLs 细菌感染时，棒本比舒巴坦的抑制作用强18。体外药敏试验证明，几乎所有产 ESBLs 细菌目前对泰能敏感，必要时可选择使用。附表 几种 TEM 类和 SHV 类 ESBLs 的氨基酸改变 内酰胺酶
12、氨 基 酸 位 置 37 102 162 235 236 237 261 TEM-1 Gln Glu Arg Ala Gly Glu Thr TEM-2 Lys TEM-3 Lys Lys Ser TEM-5 Ser Thr Lys TEM-6 Lys His TEM-7 Lys Ser TEM-8 Lys Lys Ser Ser TEM-9 Lys Ser Met TEM-10 Ser Lys TEM-12 Gln Ser TEM-15 Lys Ser TEM-16 Lys Lys His TEM-19 Ser TEM-24 Lys Lys Ser Thr Lys TEM-26 Lys Se
13、r 37 102 162 201 234 235 261 SHV-1 Gln Asp Arg Arg Gly Glu Leu SHV-2 Ser SHV-3 Leu Ser SHV-4 Leu Ser Lys SHV-5 Arg Ser Lys 注：本表摘自文献 4，略有增加。Ala=丙氨酸；Asp=天冬氨酸；Gln=谷氨酰胺；Glu=谷氨酸；Gly=甘氨酸；His=组氨酸；Leu=亮氨酸；Lys=赖氨酸；Met=甲硫氨酸；Ser=丝氨酸；Thr=苏氨酸。参考文献1 Donald JL, Olaf S, Folorunso AB, et al. Scand J Infect Dis,1996;
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