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1、免疫酶染色技术（免疫酶染色技术（ABC 法）检测各类免疫细胞的数量法）检测各类免疫细胞的数量抗体与相应抗原结合后，形成抗原抗体复合物，然而这种复合物在显微镜下是不可见的，如将特异性抗体与酶结合，再通过适当的底物显色，就可使免疫复合物由不可见而成为可见，从而确定组织细胞是否存在某种抗原。免疫酶染色技术正是根据此原理用酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记已知抗体（或抗原），然后与组织细胞在一定条件下反应，如果组织细胞中有相应抗原或抗体存在，抗原抗体就相互结合形成复合物，其中的酶分子遇到底物时，能催化底物水解、还原或氧化，产生颜色反应，从而可识别出标本中的抗原。该方法具有敏感性高，标本可长期保存
2、，而且使用一般光学显微镜就能观察等优点。但有时也存在非特异性染色影响。【基本原理基本原理】将亲合素与酶标生物素反应形成复合物（Avidin-Biotin- Peroxidase Complex，ABC），再与生物素化的第二抗体反应，借助与 T 细胞反应的抗人 T 细胞亚群的 McAb（第一抗体）介导和酶催化底物的作用，从而使阳性组织或细胞着色。【试剂及材料试剂及材料】（1） 缓冲甲醛-丙酮固定液（pH6.6）（2） pH7.4 PBS（3） 正常马血清（4） 生物素结合的抗鼠 IgG 抗体（5） 1H2O2-甲醇溶液：配制后立即使用。（6） 标准 ABC 试剂盒：其中 A 试剂为亲合素，B 试
3、剂为辣根过氧化物酶结合的生物素。（7） 二氨基联苯胺（DAB）（8） 0.5硫酸铜；0.15mol/L NaOH 溶液（9） 苏木紫溶液（10） 替代水:NaHCO3 8g，无水硫酸镁 40g，加自来水 4L 溶解。【操作方法操作方法】（1） 用 PBS 调整 PBMC 浓度至 106/ml；加 100l 淋巴细胞悬液于甩片机孔内，500r/min 离心5min，制片；将载有细胞单层的玻片在室温空气中暴露 23min，稍干即置于缓冲甲醛-丙酮液中，4 固定 30s，取出用 PBS 漂洗后再浸于 PBS 中；（2） 于每一玻片的细胞单层上加 100l 用 PBS 配制的 2马血清，在湿盒中作用
4、20min，浸于 PBS中；（3） 加一抗:将抗 CD3、CD4 和 CD8McAb（用含 2马血清的 PBS稀释成一定浓度）100l 分别加在玻片细胞单层上，并设阴性对照。置湿盒中 37温育 45min，然后用 PBS 浸洗 2 次，每次 5min；（4） 加二抗:将用 2马血清 PBS 稀释的生物素结合的抗鼠 IgG 抗体 100l 加在单层细胞上，置湿盒 37温育 30min，以 PBS 浸洗 2 次，每次 5min；（5） 将所有标本浸于 1H2O2-甲醇溶液中 30min，用 PBS 浸洗 2 次，每次 5min；（6） ABC 染色：取 A.B 试剂等量混合，在每张玻片的细胞单层上
5、加 100l ABC 试剂，置湿盒中温育 30min，然后用 PBS 浸洗 2 次，每次 5min；（7） 加底物显色：用 1H2O2 PBS 配制 0.05DAB 溶液，立即加在玻片单层细胞上，作用20min，然后用蒸馏水浸洗 2 次，每次 2min；（8） 用 0.5硫酸铜 0.15mol/L NaOH 溶液浸洗玻片 5min，再用蒸馏水浸洗 5min；（9） 用苏木紫溶液复染 1min。用蒸馏水洗去多余的染液后，再用替代水浸洗 3min；（10） 再用蒸馏水冲洗；依次用 70、95、100乙醇脱水各 1min，再浸入二甲苯内 1min，然后用盖玻片封片后镜检；【结果观察结果观察】在油镜下观察，胞浆呈棕黄色，胞核呈蓝色者为阳性细胞；胞浆和胞核均呈蓝色者为阴性细胞。计数200 个淋巴细胞，计算出阳性细胞百分率。【注意事项注意事项】（1） 制片时细胞浓度要适量，否则玻片上的细胞过多，易造成非特异性背景着色；细胞数过少，则计数困难，影响结果。（2） 在实验过程中，2马血清及 1H2O2-甲醇溶液均为阻断内源性过氧化物酶活性及减少非特异性背景着色，不可省略。浸洗步骤要严格执行，否则影响结果。
