蔗糖合成酶的测定方法

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1、蔗糖合成酶的测定方法蔗糖合成酶的测定方法一、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH(50mmol/L,pH7.5)缓冲液,包括 50mmol/L MgCI2;2mmol/LEDTA;0.2%(W/V)BSA;2%PVP;0.1%间苯二酚:称取 0.1g 溶解并定溶于 100ml 95%乙醇中。30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L 果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取 0.5g 样品(植物叶片去掉主叶脉),洗净剪碎,置于预冷的研钵中,加 3ml Hepes-NaOH 缓冲液,冰浴研磨,10

2、000g 离心 10min。2、酶活性测定依次加入 50L 粗酶液,50LHepes-NaOH 缓冲液 pH7.5,20L 50 mmol/LMgCI2,20L 100mmol/L UDPG,20L 100mmol/L6-磷酸果糖(20L 100mmol/L 果糖),30中反应 30min 后,加入 200L 2mol/L NaOH 终止反应,沸水煮 10min,流水冷却,加入 1.5ml 30%盐酸和 0.5ml 0.1% 间苯二酚,摇匀后置于 80水浴保温 10min,冷却后置于480nm 处,以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。同时取 50L 粗酶液,加入 200L 2mol/L N

3、aOH,以下同上操作,测定蔗糖含量。3、蔗糖标线制作:取 0、40、80、120、160、200g/ml 的蔗糖溶液 50L,操作同上,然后以蔗糖浓度为纵坐标,以吸光值为横坐标,得方程。4、计算样品中酶活性(gg1h1)= 式中 C反应液催化产生的蔗糖总量(g);V1提取酶液时加入的缓冲液体积(ml);V2酶反应时加入的粗酶液体积(ml)淀粉酶活性的测定淀粉酶活性的测定1 方法1.1 试剂配制淀粉酶提取缓冲液:0.1mol/L-1 柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液:用0.1mol/L-1 的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制;标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂

4、(DNS 试剂):称取 6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中,移入 1000 mL 容量瓶中,加入 325 mL 2molL-1 NaOH 溶液,再加入 45g 丙三醇,摇匀,冷却后定容到 1000 mL。淀粉和麦芽糖为 Sigma 产品,其余试剂为国产分析纯试剂。1.2 测定方法1.2.1 酶液的提取 将每一个重复的 3 个果实去皮后切碎混匀,称取其果肉 1g,置于预冷的研钵中,加2mL 预冷的 0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨,将匀浆移入 7mL 的离心管中,再分别用 1mL 的 0.1mol/L-1 柠檬酸缓冲(pH 5.6)冲洗 2 次,于 4下以

5、15000g 离心15min,上清液转移入另一个 5mL 离心管中,作为酶提取液备用。1.2.2 酶活性的测定取洁净的试管 18 支,作标记,每一个样品设 1 个对照。总反应体积为 0.5mL,测定管含 0.2mL 的酶提取液和 0.3mL 的 1%淀粉溶液;对照管含 0.2 mL 的酶提取液和 0.3mL 的0.1mol/L-1 柠檬酸溶液(pH 5.6,不含底物淀粉)将试管放入恒温 40的水浴锅中,保温30min 后取出,立即加入 1.5mL 的 DNS 试剂终止反应再将试管置于沸水浴中 10min,取出后冰浴冷却。取反应液稀释 10 倍,测定波长 520nm 处的吸光值,同上做麦芽糖标准

6、曲线,从标准曲线上查出麦芽糖的含量,计算淀粉酶的总活性。周蓓云.-和 -淀粉酶活性的测定.见:中国科学院上海植物生理研究所,上海市植物生理学会编.现代植物生理学实验指南.北京:科学出版社,1999.123124酸性转化酶活性的测定酸性转化酶活性的测定1.酶的制备和活性测定酶的制备参照 Miron&schaffer(199l)以及王永章等(2。02)的方法,稍做修改。提取缓冲液为:150mmol/lTris 一 Hcl(pH8.0),10mmol/lMgC12,10mmol/l 抗坏血酸,2mmol/LEDTA 一 Na,lmmol/LBenzadine(苯甲脒),0.1mmol/LPMSF 和

7、 0.2%(v/v) 一疏基乙醇,视发育阶段不同加入 3%(w/,)PvPP。称取一定量的果肉,加入 2-3 倍体积冷的提取缓冲液,于高速匀浆器中快速破碎组织至匀浆,16000*g 离心 20min,上清液对稀释 10 倍的提取缓冲液(不含 PvPP)透析 20h,其间更换透析液 3 次。经透析的上清液用于可溶性酸性转化酶活性和数量的测定。离心得到的沉淀物用一定体积的提取缓冲液(不含 PVPP)洗涤 3遍,离心去上清液,沉淀用 23 倍体积的含 0.5mol/LNaCI 的提取缓冲液充分悬浮后,低温(4)下振荡浸提 24h,16000*g 离心 20min,上清液透析后用于细胞壁酸性转化酶活性

8、和数量的测定。透析方法同上。可溶性酸性转化酶和细胞壁转化酶活性的测定参照 Miron&Schaffer(1991)的方法,测定反应液为 0.1mol/L 乙酸一乙酸钠缓冲液(pH4.8),0.1mol/L 蔗糖。用 3,5 一二硝基水杨酸测定其生成还原糖的量。 蔗糖合成酶的测定方法蔗糖合成酶的测定方法蔗糖是重要的光合产物,为植物体内运输的主要物质,又是碳水化合物的暂贮形式之 一。蔗糖合成酶(SS)、(SPS)是植物体内催化其合成的两种酶。这两种酶在生物体内 的功能有所不同。蔗糖合成酶(SS)以游离果糖为受体,蔗糖磷酸合成酶(SPS)以果糖- 6-磷酸为受体。后者形成的蔗糖磷酸,在蔗糖磷酸合成酶

9、的作用下形成蔗糖。一般把蔗糖 磷酸酯合成酶-蔗糖磷酸酶系统看作是蔗糖合成的主要途径,而把蔗糖合成酶看作是蔗糖分 解或形成核苷酸葡萄糖的系统。UDPG 是合成蔗糖的葡萄糖供体,故催化 UDPG 合成的 UDPG 焦磷酸化酶活力的高低与蔗糖合成的速率有十分密切的关系。 蔗糖的合成(二条途径): 1、蔗糖合成酶 (非光合组织)UDPG+果糖 蔗糖+UDP 2、磷酸蔗糖合成酶(光合组织)UDPG+F-6-P 磷酸蔗糖+UDP 磷酸蔗糖+H2O 蔗糖 +Pi 一、仪器设备 冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计 二、试剂HEPES-NaOH(50mmol/L,pH7.5)缓冲液,包括 50mmol/L MgC

10、I2;2mmol/LEDTA;0.2%(W/V)BSA;2%PVP; 0.1%间苯二酚:称取 0.1g 溶解并定溶于 100ml 95%乙醇中。 30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L 果糖 三、操作方法 1、粗酶液制备 称取 0.5g 样品(植物叶片去掉主叶脉),洗净剪碎,置于预冷的研钵中,加 3ml Hepes- NaOH 缓冲液,冰浴研磨,10000g 离心 10min。 2、酶活性测定 依次加入 50L 粗酶液, 50LHepes-NaOH 缓冲液 pH7.5, 20L 50 mmol/LMgCI2, 20L

11、 100mmol/L UDPG, 20L 100mmol/L6-磷酸果糖(20L 100mmol/L 果糖), 30中反应 30min 后,加入 200L 2mol/L NaOH 终止反应,沸水煮 10min,流水冷却,加 入 1.5ml 30%盐酸和 0.5ml 0.1% 间苯二酚,摇匀后置于 80水浴保温 10min,冷却后置于 480nm 处,以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。 同时取 50L 粗酶液,加入 200L 2mol/L NaOH,以下同上操作,测定蔗糖含量。 3、蔗糖标线制作: 取 0、40、80、120、160、200g/ml 的蔗糖溶液 50L,操作同上,然后以蔗糖浓度为纵坐 标,以吸光值为横坐标,得方程。 4、计算 样品中酶活性(gg1h1)= 式中 C反应液催化产生的蔗糖总量(g);V1提取酶液时加入的缓冲液体积(ml);V2酶反应时加入的粗酶液体积(ml)

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