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1、华中科技大学博士学位论文BK通道亚基loop区域对通道结构和功能的影响姓名：甘戈亮申请学位级别：博士专业：生物物理指导教师：丁久平20080501华华 中 科中 科 技技 大 学 博 士 学 位 论大 学 博 士 学 位 论 文文 摘摘 要要 细胞膜的存在使细胞内形成一个比较稳定的内部环境。但是，细胞的内部环境并没有完全封闭起来。它通过很多途径与外部环境之间进行物质和能量的交换。离子通道就是行使这种功能的一类重要的蛋白质。按照离子通道的门控方式进行划分，离子通道分为电压门控通道、配体门控通道、pH 门控通道和机械敏感通道四种。BK通道是一种 Ca2+和电压激活的大电导钾离子通道。它广泛地存在于
2、可兴奋性和不可兴奋性细胞中。因为，它的单通道电导是一般钾离子通道的 10 倍以上。因此，在生理过程中，BK 通道扮演着十分重要的角色。但是，在不同的组织细胞中，BK 通道往往表现出不一样的电流特性。 经过研究发现， BK 通道亚基和亚基的结合是产生这一现象的重要原因。在本文中，着重运用了电生理膜片钳、分子生物学构建、点突变、真核细胞培养以及计算机三维结构模拟等技术，探讨了2 和4 亚基的 loop区域带给 BK 通道结构与功能的变化。 本课题的主要研究结果和结论如下： （1）众所周知，BK 通道的2 亚基会带给它一个快速、完全的失活。同时，增加通道的 Ca2+依赖性。除此之外，2 亚基会使 B
3、K 通道在高电压的时候产生外向整流的性质。利用电生理以及分子生物学点突变的技术发现，在高电压情况下，整流现象的产生，主要是2 亚基 loop 上 4 个带正电荷的赖氨酸造成的。经过分析，认为当 BK 通道的亚基和2 亚基结合之后，2 亚基的 loop 部分会在 BK 通道的 pore 上方形成一个“帽子” 。几个带正电荷的赖氨酸K137、K141、K147、K150 齐聚在pore 的上方形成强大的正电荷场，从而阻止 K+从胞外进入胞内，于是就产生了外向整流。 （2）4 亚基主要表达在神经系统，特别是大脑中。它的存在会减慢通道的激活和去激活。目前已知，4 亚基带给 BK 通道最重要的性质是使通
4、道对一些毒素，如Charybdotoxin（CTX） 、Iberiotoxin（IbTX）产生了抗性，从而使毒素的阻断速率降 本研究课题得到国家自然科学基金 (30770522, 30470449, 30530140, 30770519) 资助 华华 中 科中 科 技技 大 学 博 士 学 位 论大 学 博 士 学 位 论 文文 低 1000 倍以上。这样就可以保护我们的神经系统避免受到外部毒素的侵害。通过实验，发现这种对特定毒素的抗性与一个特殊位置的酪氨酸，以及 3 个带正电荷的氨基酸有关。位于 100 位左右的酪氨酸是毒素的结合位点，有了它，毒素就可以很容易的到达通道的外口。CTX 和 I
5、bTX 的序列上都富含有正电荷的氨基酸。4亚基上的正电荷氨基酸会与毒素上的正电荷氨基酸产生互斥的作用，从而阻止毒素接近通道的 pore 部分。由于，4 亚基上没有那个特殊的可供毒素结合的酪氨酸，因此，它对于毒素的抵抗能力就更强了。 （3）通过以上的两个实验，我们知道，当 BK 通道的亚基和亚基结合之后，亚基的 loop 部分会在 pore 上方形成一个“帽子” ，从而对通道的结构和功能产生影响。因为，现在得到具体的通道蛋白晶体结构比较困难。所以，我们利用计算机三维结构模拟的方法来预测这一蛋白复合物的结构。通过分析发现，BK 通道亚基的S5 和 P-Loop 之间的 linker 部分，在不与亚
6、基结合的时候是打开向外的。这与以前得到的 Kcsa 晶体结构不一样。与亚基结合之后，这个打开的 linker 部分会向中间收拢。这个复杂的结构形成之后，4 亚基的 3 个正电荷氨基酸正好位于通道口的上方靠外的地方，这样就利于它阻止带正电荷的毒素进入通道。而2 亚基的正电荷跟4 亚基相比，在位置上发生了一定的偏移。因此，它对于毒素的阻断作用弱了很多，但是，使 BK 通道产生了外向整流的性质。 关键词：关键词：BK 通道 亚基 内向整流 毒素阻断 华华 中 科中 科 技技 大 学 博 士 学 位 论大 学 博 士 学 位 论 文文 Abstract The presence of cell mem
7、brane helps cells form the stably internal state. But the cell is not an enclosed system, which can perform material and energy exchange with surrounding environment. Ion channels are one of the important functional proteins that can pass several ions through the membrane. There are hundreds of ion
8、channels in the world and they can be distinguished based upon their gating mechanism. All the ion channels can be divided into four subtypes-voltage gated channels, ligand gated channels, pH gated channels and mechanically gated channels. BK channel is a kind of large-conductance, calcium and volta
9、ge activated potassium channel that is found in all excitable and unexcitable cells except heart myocytes. The conductance of BK channel is ten times more than general potassium channels, so it plays the key role in physiological process. In different kinds of cells, BK channel always show dissimila
10、r characteristic of macroscopic current. People have found the association with its auxiliary subunits is one of the reasons. In this study, using patch clamp, molecular biology construction, site-mutation, eukaryotic cell culture and computer 3D modeling, we study the change of function and structu
11、re conferred by loop segment of 2 and 4 modified subunit. Main results of the study are as follows: (1) Besides altering the time constant of activation and deactivation, 2 subunit bring BK channel a fast and complete inactivation and change the sensitivity to Ca2+. In addition, the channel displays
12、 the outward-rectification current when it associates with 2 subunit. Through electrophysiological and site-mutation methods, we find the rectification phenomena at high voltages are mainly generated by four positive charged amino acids in loop segment of 2 subunit. After analysis, we believe that t
13、he loop segment of 2 subunit will take place above the pore of BK channel to form a “helmet”. Several positive charged lysinesK137, K141, K147 and K150 gather above the pore of BK channel and form a strong positive charge field, thereby preventing the potassium ions from entering cells, so This work
14、 was supported by grants from the National Science Foundation of China (30770522, 30470449, 30530140, 30770519) 华华 中 科中 科 技技 大 学 博 士 学 位 论大 学 博 士 学 位 论 文文 they produced the outward rectification. (2) 4 subunit mainly expresses in nervous system, especially in brain that can slow the activation and d
15、eactivation of BK channel. Currently known, the most important nature that is brought by 4 subunit is to make the channel to be resistant to some special toxins, such as charybdotoxin (CTX) and iberiotoxin (IbTX). After association with 4 subunit, the block rate of the toxin reduces over 1000 time a
16、nd our nervous system will be kept form destroying. Through experiments, we discover the resistance to some toxin relates to a tyrosine in unique position and three positive charged amino acids. The tyrosine in 100 or so is the binding site. Toxin can be easily close to the pore of channel if there is such a tyrosine. The sequence of CTX and IbTX are both rich in positive charged amino acids. The positive charged amino acids in 4 loop seg
