《胃复宁对大鼠CAG胃粘膜异型增生及Hsp70、P53表达的调节作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《胃复宁对大鼠CAG胃粘膜异型增生及Hsp70、P53表达的调节作用（59页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、陕西中医学院硕士学位论文胃复宁对大鼠CAG胃粘膜异型增生及Hsp70、P53表达的调节作用姓名：茹立良申请学位级别：硕士专业：中西医结合临床指导教师：支江平20100401摘 要 目的：研究胃复宁对大鼠慢性萎缩性胃炎（CAG）实验动物模型的治疗效果，观察大鼠胃粘膜组织 Hsp70、P53 的表达及胃粘膜组织病理学的变化，探讨 CAG 发生发展的病理机制及胃复宁治疗 CAG 的部分作用机理，为 CAG 异型增生（Dys）的病理逆转提供科学依据，阻断 CAG 向胃癌的发展进程。 方法：实验动物适应性喂养一周后随机分为 A 组(空白对照组 16 只)和造模组，A组常规饲养，造模组以 MNNG 为主要
2、药物诱导的综合造模方法成功建立大鼠 CAG 实验动物模型；造模成功后造模组随机分为 B 组(胃复宁大剂量治疗组 18 只)；C 组(胃复宁中剂量治疗组 18 只)、D 组(胃复宁小剂量治疗组 18 只)、E 组(维酶素治疗组 18只)、F 组（模型组 18 只） ；造模成功后 B、C、D 组每日每只分别予以胃复宁大剂量 (20g/kg)、中剂量(10g/kg)和小剂量(5g/kg)2ml 灌胃，每日一次，(药物经过常规煎煮、过滤、水浴蒸发)；E 组：施以维酶素(2mg/kg)2ml 灌胃，每日一次；模型组予以生理盐水 2ml 灌胃，每日一次。实验结束观察大鼠 CAG 实验动物模型胃粘膜组织病理
3、学改变；免疫组化技术检测各组大鼠胃粘膜组织 Hsp70、P53 表达。 结果：实验第 24 周、实验结束各组大鼠体重有显著性变化（P0.05） ；造模后施加胃复宁大、中剂量治疗组与小剂量治疗组比较有显著性差异（P0.05). The therapy group B,C and therapy group D have significant changes in the contents of Hsp70,P53 in gastric mucosa tissues expression(P50%为(+)。 “+、 +、 +”均为阳性 3 实验材料与方法 3.1 实验材料 3.1.1 实验动物
4、雄性 SD 大鼠 110 只，清洁级，鼠龄 6 周，体重 99.4810.14g，西安交通大学医学院实验动物中心提供并提供标准 SD 大鼠颗粒饲料及垫料、辅料。动物质量合格证书号：2007-001，质量负责人：刘恩岐。 3.1.2 实验药物 胃复宁：由黄连 6g、蒲公英 15g、川芎 10g、益母草 20g、陈皮 10g、厚朴 10g、黄芪 20g、 白术 10g 等组成， 制成胃复宁煎剂， 陕西中医学院附属医院制剂中心提供。 维酶素片：新乡恒久远药业有限公司生产，批号：20080814。 N-甲基-N-硝基-亚硝基胍MNNG(Fluka 公司产品) ：东京化成工业株式会社生产。 盐酸雷尼替丁
5、胶囊：四川省通园制药有限公司，批号：080801。 10%水合氯醛：陕西中医学院附属医院制剂中心提供，生产日期：20090621。 3.1.3 主要试剂 系列浓度医用酒精、水杨酸钠、2%戊巴比妥钠、10%甲醛溶液、石蜡、HE 染色剂：由陕西中医学院病理实验室提供。 Hsp70 测定试剂盒购自美国 Dako 公司(福州迈新生物技术有限公司提供)。阳性胃复宁对大鼠 CAG 胃粘膜异型增生及 Hsp70、P53 表达的调节作用 25对照 DAB 显色剂(购自武汉博士得公司)。 P53 测定试剂盒测定试剂盒购自美国 Dako 公司(福州迈新生物技术有限公司提供)。阳性对照 DAB 显色剂(购自武汉博士
6、得公司)。 3.1.4 主要仪器 架盘药物天平： 北京医用天平厂生产。 电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9075A型） ：由陕西中医学院病理实验室提供。 电热恒温干燥箱（GQ70B-2 型） ：由陕西中医学院病理实验室提供。 日本奥林巴斯光学显微镜：由陕西中医学院病理实验室提供。 超薄切片机 （ERMA） ：由陕西中医学院病理实验室提供。 电子秤 FAIO0N4：上海精科公司。 台式离心机：上海安亭科学仪器公司。 数显恒温水浴箱：周华电器有限公司。 组织冷冻包埋机 BM-VI：湖北孝感市电子仪器厂。 手术器械：陕西中医学院临床学院实验室提供。 3.2 实验方法 3.2.1 动物分组及给药方法 全部
7、大鼠称重标号后分组：随机抽取 16 只作为空白对照组（A 组） ，其余大鼠随机分笼饲养，给予采用以 MNNG 为主诱导的综合造模方法进行造模。 A 组：空白对照组标准颗粒饲料常规喂养，自由采食进水，36 周后与造模组大鼠一同麻醉后处死。 造模组：施加综合造模措施，24 周后任意取出四只麻醉后处死，取全胃，摘离腺胃， 行病理组织学检测各项指标， 验证造模成功后， 剩余大鼠随机分为胃复宁大 （B组） 、中（C 组） 、小（D 组）剂量治疗组，维酶素治疗组（E 组） 、模型组（F 组） 。 B 组：施以备置好的中药混悬液大剂量胃复宁：每日每只分别予以胃复宁大剂量 (20g/kg)2ml 灌胃(药物经
8、过常规煎煮、过滤、水浴蒸发，给药时依据大鼠体重不同取药量不同而后稀释至 2ml)，每日 1 次，相当于成人剂量的 30 倍。连续 12 周。 C 组：施以备置好的中药混悬液中剂量胃复宁：每日每只分别予以胃复宁中剂量(10g/kg) 2ml 灌胃，每日 1 次，相当于成人剂量的 15 倍。连续 12 周。 D 组：施以备置好的中药混悬液小剂量胃复宁：每日每只分别予以胃复宁小剂量 (5g/kg) 2ml 灌胃，每日 1 次，相当于成人剂量的 7.5 倍。连续 12 周。 陕西中医学院 2010 届硕士学位论文 26E 组：施以维酶素(2mg/kg)2ml 药液灌胃，每日 1 次，连续 12 周。
9、F 组：施以生理盐水灌胃 2m1/次，每日 1 次，第 36 周后同中、西药治疗组结束实验，行病理学及免疫组化指标测定。 B-F 组大鼠 24 周造模成功后解除造模因素，给予普通块料喂养，自由采食进水，连续 12 周。 3.2.2 CAG 模型制作126 3.2.2.1 SD 大鼠 110 只，标准饲料适应性喂养 1 周后，随机抽取 16 只为空白对照组常规饲养，标准普通块料喂养，自由采食进水，将剩余大鼠随机分笼采用以 MNNG 为主诱导的综合造模方法建立 CAG 病变实验动物模型，为期 24 周127。 所有实验组大鼠（110 只）置空调房，室温 22，相对湿度 50%，除空白对照组外其余大
10、鼠取 N-甲基-N-硝基-亚硝基胍（MNNG）2g，用蒸馏水 2000ml 配成 1g/L 的保存液，避光 4保存，用前以自来水稀释为 50ug/ml 浓度的溶液，装入涂有黑漆的避光饮水瓶内给大鼠自由饮用，每 24h 更换一次药液。造模期间不再给于其它饮水。 盐酸雷尼替丁胶囊按每天 0.03g/kg 灌胃，每日一次。并严格遵守实验组大鼠灌胃前后禁食禁水 1 小时严格规范操作。 3.2.2.2 对造模组实验大鼠每日均用专用夹子夹尾 1 次，使其保持激怒争斗状态，持续 1 小时。 3.2.2.3 饥饱失常法：依据随机区组实验设计方法实施饱食与饥饿处理，以日期为序号，每三日为一组（可设序号 1、2、
11、3） ，任取两组（如取 1、2 组）喂食，一组（如取 3 组）禁食，参照随机数字表，真正做到饥饱失常。 3.2.3 观察方法与指标 实验第 24 周末，随机抽取四只造模组大鼠麻醉后处死，取胃粘膜组织标本发现胃粘膜明显变薄，粘膜皱襞平坦，色苍白，液少，可见不同程度的出血点，伴点状糜烂，符合 CAG 典型病理改变，验证造模成功,标本留存与参与随机分组后模型组大鼠的指标检测。 实验第 36 周末，所有实验组大鼠禁食不禁水 12 小时，末次给药后 2 小时，10%水合氯醛溶液麻醉，剖开大鼠腹腔取大鼠全胃，摘离腺胃，沿大弯间剪开，做肉眼观察，每个实验操作者详细记录剖开胃粘膜组织的大体观，典型者给予影像学
12、资料保存，余胃粘膜组织置 10%中性福尔马林液中，固定 24 小时后取胃窦部胃粘膜组织剪成约 2mm 的条状物，石蜡包埋，常规切片，HE 染色，按常规病理制片方法，每只胃复宁对大鼠 CAG 胃粘膜异型增生及 Hsp70、P53 表达的调节作用 27大鼠在胃窦部制石蜡切片 6 张，依次进行常规病理学检测，观察病理组织学改变，胃粘膜组织学改变的诊断标准参照实验性胃腺癌的分类和诊断标准128。免疫组化技术行 hsp70、P53 表达的检测。 4 实验结果分析 4.1 统计学方法 采用 SPSS16.0 统计软件进行分析，计量数据以均数标准差(XS)表示，组间差异采用单因素方差分析，两两比较采用t检验
13、。等级资料采用两个独立样本的非参数检验的两两比较的秩和检验。P0.05)无明显差别； 实验第 24周造模成功空白对照组与其它各组相比(P0.05)，无明显差别，没有统计学意义，提示分组的随机化原则；实验结束后除空白对照组与胃复宁大剂量治疗组(P=0.0390.05)、中剂量治疗组(P=0.1480.05)比较，与维酶素治疗组比较(P=0.0840.05)，无明显差别。与模型组、小剂量治疗组比较(P0.05） ，与维酶素治疗组（P=0.0980.05） ，无明显差异，与小剂量治疗组、模型组比较（P0.05） ，无明显差异，与小剂量治疗组（P=0.0170.05） ，无明显差异。 维酶素治疗组与模
14、型组比较（P=0.0080.05） ，与维酶素治疗组相比（P=0.5340.05 ） ， 无 明 显 差 异 ， 与 胃 复 宁 小 剂 量 治 疗 组 、 模 型 组 比 较（P=0.0020.05） ，无明显差异，胃复宁中剂量治疗组与胃复宁小剂量治疗组 （P=0.0280.05） ，无明显差异。 维酶素治疗组与模型组比较（P=0.0370.05） ，有显著性差异。 以上资料表明：空白对照组与其它各组比较（P0.01） ，有非常显著性差异，提示 CAG 病理因素的长期性，治疗是一个慢性进程；相对阳性对照药物胃复宁大、中陕西中医学院 2010 届硕士学位论文 34剂量治疗组作用较好，证明胃复宁
15、治疗效果的确定性，且胃复宁大、中剂量治疗组作用优于维酶素治疗组作用；维酶素治疗组与胃复宁小剂量治疗组及模型组有显著性差异，证明维酶素治疗作用的可靠性，作为阳性对照药物的可行性； ；胃复宁小剂量治疗组与模型组无明显差别提示胃复宁小剂量治疗组有一定的治疗作用，但作用较差；模型组与其它实验各组的显著性差异，提示 CAG 的自愈性差，需积极人为干预，及时治疗，防止病变的发展变化，促进疾病向良性方向转化，切断 CAG 的恶化与进展。上述指标的统计结果证明胃复宁大、中剂量治疗组能够明显促进胃粘膜组织细胞的修复，逆转 Dys，干预 Hsp70 的表达，阻断 CAG 向胃癌的发展，从而发挥保护胃粘膜的作用，且
16、胃复宁大、中剂量治疗组作用优于维酶素治疗组作用。 5 讨论 5.1 CAG 模型制作原理 化学致癌剂造模法129-132有多家报道使用N-甲基-N-硝基-亚硝基胍(MNNG)溶液可致CAG，综合因素致模成功报道较多，能较好的模拟CAG发病的病因。 用 MNNG 诱导造模方法建立 CAG 病变动物模型，加之情绪刺激、饥饱失常、盐酸雷尼替丁胶囊按每天 0.03g/kg 灌胃，每日一次，综合造模 24 周，造模后与空白对照组比较差异明显，进一步证明造模方法的可行性，造模成功后的病理组织学改变符合CAG 的病理改变特点。 CAG 病变动物模型复制成功与各种致病因子破坏大鼠胃粘膜屏障，使正常的腺体增殖修复作用受损，引发胃粘膜炎性反应，胃粘膜细胞剥脱，抑制胃粘膜生长，使其失去正常的抵抗力，与中医的脾胃受损、气血乏源理论一致。总之，各种致病因子长期刺激，致胃粘膜屏障破坏，使炎症损害因素通过上皮细胞紧密连接，进一步形成胃粘膜深层损害与腺体破坏，使胃粘膜不能完全修复再生，从而发生胃粘膜腺体萎缩和/或肠上皮化生。 5.2
