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1、针药结合对糖皮质激素造模骨质疏松大鼠 BMC、BMD 及骨代谢影响的实验研究 景涛1、2 贾叶1 成守仁2 卢小健2 （1.南京中医药大学第一临床医学院 210046； 2.南京体育学院医院 210014） 摘要：目的摘要：目的 探讨针药结合对糖皮质激素造模骨质疏松大鼠 BMD、BMC 及骨代谢影响的作用原理与机制。方法方法 选 用 3 月龄雌性 SD 大鼠 40 只，体重 17010g,随机分为空白对照组、模型组、药物组、针药组，每组 10 只。各组 大鼠连续造模和治疗 12 周后，扫描测得大鼠腰椎 BMC 和 BMD，并用放免法检测血清 E2、FSH、LH、CORT、ACTH、CRH 的指
2、标水平。结果结果 模型组大鼠 BMC、BMD 明显低于空白对照组和治疗组 (P0.05)，与药物组比较 有显著性差异(P 0.05). but there were significant differences between acupuncture-drug combination group and drug group (P (相当于强的松) 7.5mg/d。尽管现代医学已经发展到一个很高的水平， 但对于因激素治疗所带来的副作用仍然没有很好的防 治手段。GCS 治疗可以引起多种不良反应，其中糖皮质 激素诱导的骨质疏松症(glucocortiocoids-induced osteopor
3、osis，GIO)可以导致椎体、肋骨、髋部等多 个部位骨折，严重影响了患者生活质量并增加社会负 担，是 GCS 的严重并发症之一，目前尚无有效的治疗 手段1、2。笔者在以往的临床研究中发现针灸对原 发性骨质疏松症有明显的治疗效果，为探讨糖皮质激 素诱导骨质疏松的机制以及有效的干预措施，笔者进 行了针药结合对糖皮质激素性骨质疏松模型的研究。 1.1.材料材料 1.11.1 实验动物实验动物 SD 清洁型雌性大鼠 40 只，由上海莱克实验动物有 限责任公司提供，许可证号 SCXK（沪）2003-0003。 1.21.2 药物药物 阿伦膦酸钠片（石家庄制药集团欧意药业有限公 司。产品批号：00906
4、0301）：有效期：2012.03.26。 地塞米松磷酸钠注射液(江苏涟水制药有限公司。产品 批号：E090725)：有效期：2012.05.30。 1.31.3 试剂盒试剂盒 (1).美国 ADL goat antirat Adrenocorticotropic Hormone Elisa 测定试剂盒 （Catalog No：ADL CD-A011 Lot No：RT110371 有效 期：JUN 2012） 。 (2).皮质醇放射免疫分析药盒 50T1 批号： 20101101。 (3).雌二醇放射免疫分析药盒 50T1 批号： 20101101。 (4).卵巢促激素放射免疫分析药盒 50
5、T1 批号： 20101029。 (5).促黄体生成激素放射免疫分析药盒 50T1 批号：20101029。 1.41.4 主要实验设备及仪器主要实验设备及仪器 (1)三级动物实验室（医学实验动物环境为鼠类 实验室，清洁级，合格证书 23-0 1 6，南京 中医药大学提供） 。 (2).美国产 lead-tech 型超低温冰箱 (3).美国 GE 公司产 LUNAR DPX-MD+型双能 X 线骨密度仪 (4).德国产 Labsystems Finnpipette 50、100l 型移液器 (5).HH-4 型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）(6).芬兰产 Thermo Multiskan
6、Spectrum spectrophotometer 型酶标仪 (7).sn-695B 型 智能放免 测量仪（上海原子核 研究所日环仪器一厂） 2 2方法方法 2.12.1 动物分组动物分组 将 40 只 SD 清洁型雌性大鼠观察 1 周后， 随机分为四组：空白对照组、模型组、药物组、针药 结合组，每组各 10 只。 2.22.2 动物造模动物造模 将 40 只雌性大鼠随机分为四组：空白 对照组、模型组、药物组、针药结合组，每组各 10 只。 各组动物均在 1824通风良好，湿度在 60-70%的环 境下饲养，自由饮水、摄食。 （1 1）空白对照组：）空白对照组： 同时每日用注射器灌胃生理盐水
7、 （灌胃剂量为：1ml） 。 （2 2）模型组：）模型组： 每周 2 次肌肉注射地塞米松，每次注 射量为：0.2mg/100g，连续用药 12 周。同时，每日用 注射器灌胃生理盐水（灌胃剂量为：1ml） 。 （3 3）药物组：）药物组： 每周 2 次肌肉注射地塞米松，每次注 射量为：0.2mg/100g，连续用药 12 周，同时采用灌胃 法给予阿伦膦酸钠片剂的水溶悬浊液每日灌胃次， 每次 10mg/kg，连续用药治疗 12 周。 （4 4）针药结合组：）针药结合组： 除采用药物组的造模和药物治疗 方法外，同时每天接受电针治疗 1 次。其具体方法为： 选用下三里穴位，取穴方案按照华兴邦氏的方法实
8、施， 用细美容针刺入穴位后，接电针仪进行电针刺激，连 续脉冲波、频率 3-4Hz、强度 4-5mA，以动物局部轻度 抖动为度，每次 10 分钟，每日 1 次，连续治疗 12 周。 每 2 周为 1 个电针疗程，暂停电针治疗 1 次。 各组大鼠造模和治疗 12 周后，摘除眼球取血，分 离血清，置于-20冰箱保存集中待测。 2.32.3 检测指标检测指标 2.3.12.3.1 骨密度检测：骨密度检测： 大鼠处死前 1 天，用 DEXA 骨密度 仪及所附小动物梯级标准模型和分析软件在其腰椎体 进行扫描，得出大鼠腰椎的骨密度（BMD）和骨含量 （BMC） 。( 注：大鼠 BMD、BMC 扫描部位 L3
9、 ) 2.3.22.3.2 生化指标测定生化指标测定 促肾上腺皮质激素（促肾上腺皮质激素（ACTHACTH） 、促肾上腺皮质激素释放激、促肾上腺皮质激素释放激 素（素（CRHCRH）测定）测定 首先，测定前将试剂盒放置室温40分钟，所有试 剂在使用前都轻轻摇匀； 准备浓缩洗涤液与新鲜的医 用双蒸水（1：20倍稀释） ，混匀后室温放置待用。取 出酶标板，依照次序对应分别加入100l的标准品于 空白微孔中（不同浓度的标准品移液时，采用不同的 吸头） ；分别标记样本编号，加入100l 血清于空白 微孔中（不同的样本采用不同的吸头） ；在标准品孔中 和样品孔中加入50l的酶标记溶液，用移液器反复吸 打
10、，进行混匀（不同的微孔取液采用不同的吸头） ；轻 微摇动酶标板，使得液体充分混匀，用保险膜密封酶 标板，然后置于37的水浴锅中准确水浴60分钟。然 后将酶标板取出，将其中的液体甩去，每个孔中全部 加满洗涤应用液后，立即甩去液体；每个孔中再次全 部加满洗涤应用液后，室温静置2分钟，其间每隔20- 30秒轻微振摇酶标板。2分钟后将孔中的洗涤应用液甩 去，在吸水纸上将酶标板拍干。再重复第个步骤6次；在吸水纸上将酶标板底部 上残留的水渍擦干；在每个孔中加入底物A 50l（不 同的微孔取液采用不同的吸头） ；在每个孔中加入底物 B 50l（不同的微孔取液采用不同的吸头） ，用移液 器反复吸打，进行混匀；
11、轻微振摇酶标板，然后在 37水浴锅中避光反应15分钟（酶标板置于铝制饭盒 中进行反应） ；每个微孔中加入50l的终止液， （不同 的微孔取液采用不同的吸头） ，用移液器反复吸打，进 行混匀；在Thermo Multiskan Spectrum spectrophotometer酶标仪上，450nm处测定OD。 标准曲线的制备： 以B/T计算NSB、S0结合百分率， 以B/B0计算标准及待测样品结合百分率，在半对数坐 标纸上绘制标准曲线，并查出样品值。或由自动计 数器预先编制程序，直接给出有关参数，标准曲线及 样本浓度。 NSB（NSB管的cpm数T管的cpm数）100 Bo（Bo管的cpm数N
12、SB管的cpm数）T管的 cpm数100 BBo（标准或样品管的cpm数NSB管的cpm 数）（Bo管的cpm数NSB管的cpm数）100 以Logit=ln（B/B0）/（1-（B/B0） ） 为横坐标， ln浓度为纵坐标，作标准曲线。 皮质醇（皮质醇（CORTCORT）雌二醇（）雌二醇（E2E2） 、卵巢促激素（、卵巢促激素（FSHFSH） 、 促黄体生成激素（促黄体生成激素（LHLH）放射免疫测定）放射免疫测定 操作步骤（直接 取大鼠血清100ul进行测定） ，操作步骤（直接取血清 50l进行测定）充分混匀，室温放置15min后， 4 3500rpm离心15min，吸弃上清液，在计数器上
13、测定 各管沉淀的放射性计数cpm。 2.42.4 统计学处理统计学处理 所有实验进行数据均使用 SPSS11.5 版统计软件处 理，检测结果以均数（ S）表示，多组间差异的 显著性采用单因素方差分析（F 检验） ，用student-newman-kruls法进行组间的两两比较。3 3结果结果 3 31 1 骨密度（骨密度（BMDBMD）检测）检测 表1 各组实验动物腰椎体的BMD对比（ S；n=10） Tab.1 Comparison of BMD on lumber（L3）of vertebra of experimental rats in groups（ S; n=10）g/cm2 组别
14、 第 3 腰椎体（g/cm2） 针药组 0.3690.0165* 药物组 0.3170.0130* 模型组 0.2370.0154 空白组 0.395 0.0121# 说明：12 周治疗后，第 3 腰椎体 BMD 与模型组比 较：*P0. O5；*P0. O5；*P0. O5；*P0. O5；*P0. O5；*P0. O5；*P0.05)， 优于药物组；与针药 结合组比较，模型组的 BMD、BMC 水平最低 （P0.05） 。 上述针药结合组与模型组和药物组之间的 BMD、BMC 显著的差异可以说明，针灸可能通过对神 经内分泌网络的调节，而促进局部环境中许多细胞因 子等一系列极为复杂地改变，并
15、通过对机体全身性、 多环节的调节作用，而增加性腺上雌激素的受体敏感性或雌激素的受体数量；从而最终影响骨组织的微环 境而提高成骨细胞的活性，调节内环境微量元素的平 衡，促进矿物质在骨中的沉积，促进骨形成，抑制骨 吸收，纠正骨代谢的负平衡状态，防止了骨质的进一 步丢失，进而发挥抗 OP 的作用。 在本研究中，针刺后 E2、FSH、LH 的水平提高， 可能就是通过调节下丘脑垂体性腺轴功能的作用 来提高卵巢中未完全闭锁的卵泡以及垂体雌激素受体 的基因表达及雌激素活性，进而促进了睾酮向雌二醇 的转化，从而使血清中 E2 水平得到提高的。同时针刺 后 CORT、ACTH、CRH 的水平提高，亦可能是通过 下丘脑垂体肾上腺皮质腺轴的功能来发挥作用的。 正因如此笔者认为上述 6 种激素在各组所存在的差异 也可能与针药结合治疗组运用针刺进行预防性治疗， 进而在调节下丘脑垂体肾上腺皮质腺轴的同时又 参与调节下丘脑垂体性腺轴的功能有关。本实验 的结果在一定程度上支持了这一说法。 参考文献： 1 National Osteoporosis Foundatio
