基因工程复习提纲-完善

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1、复习提纲 1什么是基因？ 基因：DNA 分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2基因工程的诞生 基因工程诞生于 1973 年。 19731974 年，美国科学家科恩等以大肠杆菌为材料，成功地进行了三次基因工程试 验。试验结果证明，用基因工程可以打破不同物种间在亿万年中形成的天然屏障，任 何不同种类生物的基因都有可能通过基因工程技术而组合到一起。人类进入了激动人 心的基因工程时代。 3基因工程的定义及三大基本元件。 定义：基因工程是指重组 DNA 技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两 大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组 D

2、NA 技术） ； 而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 三大基本元件：限制性核酸内切酶（restriction enzymes）/DNA 连接酶（ligase）/ 基因工程载体（vector） 4基因工程的研究内容 (1) 从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的 DNA 片段； (2) 在体外，将带有目的基因的 DNA 片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体 分子上，形成重组 DNA 分子; (3) 将重组 DNA 分子引入（转）到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞); (4) 从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组 DNA 分子的细胞克隆;

3、(5) 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能 表达，产生出所需要的物质。 5基因工程的技术准备及技术支撑。 技术准备 技术支撑： 核酸凝胶电泳技术 核酸分子连接技术/细菌转化技术/DNA 序列分析技术/寡核苷酸合成技术/基因定点突变 技术/聚合酶链式反应（PCR）技术 5基因工程的基本用途 分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源 大规模生产生物活性物质 设计、构建生物的新性状甚至新物种 基因工程在农业生产中的应用 1.提高植物的光合作用效率 2.提高豆科植物的固氮效率 3.转基因植物 4.转基因动物 基因工程在工业中的应用 1.纤维素的开发利用 2.酿酒工业

4、 基因工程在医药上的应用 1.用转基因植物或动物生产药物 2.用微生物生产药物 3.设计高效高特异性的生物制剂 4.研制疫苗 5.基因诊断 6.法医鉴定 7.基因治疗 基因工程在环境保护中的应用 1.检测水污染 2. 生物降解7核酸酶的分类 1）根据核酸底物分 RNA 酶（Rnase）/DNA 酶（Dnase）/底物非专一性核酸酶； 2）根据作用方式分 内切核酸酶（endonuclease）/外切核酸酶（exonuclease） ； 3) 根据对底物碱基专一性分 碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性） 非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性） 8细菌中的防卫系统：限制与修饰现象

5、。 （1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源 DNA 进入体内。这种感受态可以 是人为的，也可以是在自然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源 DNA， 细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。 （2）限制性核酸内切酶：可以帮助细菌限制外来 DNA 的入侵 （3）甲基化酶：对该特异位点的碱基进行甲基化修饰，被修饰的 DNA 就不再被相应的 限制酶切割了。 （4）细菌自身的 DNA受到甲基化修饰，得以保存。 （5）外源入侵的 DNA未来得及甲基化，被降解 。 9作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（如 DH5）的必须条件 （1）rec 基因缺陷型的突变体，保证必须不与外来 DNA 分子发生

6、遗传重组； （2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株，保证外来 DNA 分子不会受其限制 酶的降解。 10限制性核酸内切酶 （1）最重要的是哪一类？II 型 （2）命名 （3）II 型限制性内切酶的基本特征 1.识别双链 DNA 分子中 4 - 8 对碱基的特定序列 2.大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 3.识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 4.某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变 （4）回文结构 序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全 一样的。 （5）限制性内切酶形成的末端结构 粘末端：两条链上的断裂位置是交错

7、和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂 结果形成具有粘末端的 DNA 片段； 平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有 平末端的 DNA 片段。 （6）Star activity 一些限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，如甘油浓度过高、反 应液离子强度过低、pH 改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。 （7）同裂酶：一类来源不同，但识别靶序列相同，切割位点可以相同也可以不同的酶。（8）同尾酶：一类来源不同，识别靶序列不同，但是都产生相同的粘性末端的酶。 （9）同位酶：一类识别靶序列相同，但切割位置不同的酶。（10）限制酶的识

8、别序列与 DNA 的来源无关，不带有种的特征，对各种 DNA 都普遍适 用；（11）在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌（识别序列中特定核苷酸 的甲基化会强烈抑制限制酶的活性） 11DNA 聚合酶 （1）大肠杆菌 DNA 聚合酶 I（DNA pol I）的用途：缺口平移（ Nick translation ） 53的核酸外切酶和聚合酶活性协同作用，使缺口向前推进 （2）大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 大片段（Klenow） 性质: Klenow 酶仍拥有 53的 DNA 聚合酶活性和 35的核酸外切酶活性，但 失去了 53的核酸外切酶活性。 用途：补平由核酸内切酶产生的 5粘性末端/cDN

9、A 第二链的合成 （3）T4-DNA 聚合酶 性质：53的 DNA 聚合酶活性和 35的核酸外切酶活性/在无 dNTP 时，可以 从任何 3-OH 端外切/在只有一种 dNTP 时，外切至互补核苷酸暴露时停止/在四种 dNTP 均存在时，聚合活性占主导地位 用途：切平由核酸内切酶产生的 3粘性末端 （4）依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶（反转录酶） 基本特性：以 RNA 为模板聚合 cDNA 链/双向外切 DNA-RNA 杂合链中的 RNA 链 主要用途：将真核基因的 mRNA 转录成 cDNA，构建 cDNA 文库/对具有 5突出端的 DNA 片段的 3端进行补平和标记、制备探针 12DN

10、A 连接酶：形成磷酸二酯键（DNA 连接酶并不能连接两条单链 DNA 分子或环化单 链 DNA 分子，被连接的 DNA 链必须是双螺旋的一部分） （1）防止连接反应中载体或目的基因的自我环化 1.双酶切 2.碱性磷酸酶去除 5-P 3.调整反应物比例(P102) （2）平末端 DNA 片段的连接方法 1.直接用 T4 DNA 连接酶连接（需 ATP 和高浓度酶，效率不高） 2.TdT 同聚物加尾法 3.用衔接物连接平末端 DNA 分子（T4 DNA Ligase） 3.DNA 接头连接法 11核酸酶（nuclease） （1）单链核酸内切酶S1 核酸酶的 基本反应：内切单链 DNA 或 RNA

11、/内切带缺口或裂口的双链 DNA 或 RNA 用途：去除 DNA 片段的单链突端，使之成为平端/去除 cDNA 合成时形成的发夹结构/施 行 S1 核酸酶保护实验，分析转录产物/成熟 mRNA 与基因组 DNA 杂交后，结合此酶水解， 可定位内含子/修整渐进性删除突变的末端 （2）单链内切、双链外切的核酸酶：Bal31 核酸酶 特性：从双链 DNA 的两端 3和 5同时开始水解两条链，对两条链的水解速度不一定 相等，结果是双链从两头缩短，彻底水解为 5单核苷酸。 12核酸修饰酶（Nucleic Acid modification enzymes） （1）末端脱氧核苷酰转移酶（TdT） 基本特性

12、：不需要模板的 DNA 聚合酶，在 3端随机掺入 dNTPs 用途：给载体或目的 DNA 加上互补的同聚物尾/DNA 片段 3末端的同位素标记 （2）碱性磷酸单酯酶（CIP、BAP） 反应：去除 5-P，成为 5-OH 目的：1.去除载体 DNA5端磷酸，防止载体自身环化，提高重组率2.去除 DNA 和 RNA 的 5-P，然后用 T4 多聚核苷酸激酶作用下进行末端标记。 （3）T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP） 特性：催化 ATP 的 g-磷酸基团转移至 DNA 或 RNA 的 5-OH 末端上 用途：用于探针的末端同位素标记 13核酸凝胶电泳结果处理软件：quantity one（了解

13、） 14基因克隆载体： 概念：能够运载外源 DNA 片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外 源 DNA 片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类 DNA 分子 种类：质粒（plasmid）/噬菌体或病毒 DNA/考斯质粒（cosmid）与噬菌粒/人造染色体 载体 功能：1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 应具备的条件： 1.可转移性：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性 2.具有与受体细胞相适应的复制位点（ori，origin of replication）或整合位点 3.具有较高的

14、外源 DNA 的装载能力 4.多克隆位点（multiple cloning site, MCS）：具有多种限制性内切酶的单一切点 5.具有合适的筛选标记（selection marker） 6.安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其他生物细胞中 （1）质粒：质粒是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制，并被稳定遗传的 一类核酸分子。天然 DNA 质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即 cccDNA （2）什么是质粒的不相容性及其机制； 不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中， 这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。

15、 机制：两种含有不同复制子结构的质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节， 致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共 处于同一细胞内。 两种含有相似复制子结构的质粒，在复制时受同一种拷贝数控制系统的控制而产生竞 争，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中 更具优势，并逐步将另一质粒“稀释”淘汰。 （3）根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型（严紧型 和松弛型） ，其中氯霉素的作用（蛋白质合成抑制剂，使染色体 DNA 合成受阻，松弛型 继续扩增，极大提高拷贝数） ；根据是否可以在细胞间转移，质粒可以分为

16、（结合型和 非结合型） ； （4）质粒的性质 自主复制性(质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统进行自主复制)、不相容性、可转移 性 （5）一个合格质粒的组成要素 1.具有复制起始位点(Ori)或整合位点 2.具有两种易被检测的选择性标记(抗生素抗性基因) 3.具有多种限制酶的单一识别位点(多克隆位点 MCS) 4.具有尽可能小的相对分子质量 5.属于松弛型复制6.属于非传递型质粒 7.具有较高的外源 DNA 装载能力 8. P/E（Promoter/Enhancer）：启动子/增强子 9. T（Terminator）：终止信号 10. poly(A)加尾信号：稳定 mRNA （6）如何阅读质粒图谱（7）重要的大肠杆菌质粒载体pBR322 松弛型复制/氯霉素可扩增/拷贝数每细胞 50-100 /用于基因克隆 pUC18/19 拷贝数 2000-3000/cell 装有多克隆位点（MCS