用用 16S rDNA 方法鉴定细菌种属方法鉴定细菌种属一、目的一、目的1. 掌握 16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握 DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作二、原理二、原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA 杂交、rDNA 指纹图、质粒图谱和 16S rDNA 序列分析等细菌中包括有三种核糖体 RNA，分别为 5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA 基因由保守区和可变区组成16S rRNA 对应于基因组 DNA 上的一段基因序列称为 16S rDNA5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是 16S rRNA 的两倍，分析较困难而 16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用 16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析利用 16S rDNA 鉴定细菌的技术路线：三、操作步骤三、操作步骤（一）细菌基因组（一）细菌基因组 DNA 提取提取1. 挑单菌落接种到 10 mL LB 培养基中 37℃振荡过夜培养。
2. 取 2 mL 培养液到 2 mLEppendorf 管中，8000 rpm 离心 2 分钟后倒掉上清液3. 加 140 μLTE 打散细菌，再加入 60 μL 10 mg/ml 的溶菌酶37℃放置 10 分钟4. 加入 400 μL Digestion Buffer，混匀再加入 3 μL Protein K，混匀，55℃温育 5 分钟5. 加入 260 μL 乙醇，混匀，全部转入 UNIQ-10 柱中10000 rpm 离心 1 分钟，倒去收集管内的液体6. 加入 500 μL 70％乙醇（Wash Solution） ，10000 rpm 离心 0.5 分钟细菌培养液基因组 DNADNA 提取PCR 扩增16S rDNA 片段片段回收连接克隆载体阳性克隆鉴定测 序序列比对7. 重复第六步8. 再 10000 rpm 离心 2 分钟彻底甩干乙醇吸附柱转移到一个新的 1.5 mL 的离心管9. 加入 50 μL 预热(60℃)的洗脱缓冲液，室温放置 3 分钟12000 rpm 离心 2 分钟，流下的液体即为基因组 DNA10. 电泳取 3 μL 溶液电泳检测质量二）（二）PCR 扩增扩增1. 根据已发表的 16S rDNA 序列设计保守的扩增引物。
16S (F) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'16S (R) 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'2. PCR 扩增体系：在 0.2 mL Eppendorf 管中加入 1μL DNA，再加入以下反应混合液：16S (F) 1μL (10μM)16S (R) 1μL (10μM)10×PCR Buffer 5 μLdNTP 4 μLTaq 酶 0.5 μL加 ddH2O 使反应体系调至 50 μL，简单离心混匀3. PCR 反应将 Eppendorf 管放入 PCR 仪，盖好盖子，调好扩增条件扩增条件为：94℃ 3 min94℃ 30 sec 50℃ 45 sec 35 cycles72℃ 100 sec72℃ 7 min4. PCR 产物的电泳检测拿出 Eppendorf 管，从中取出 5 μL 反应产物，加入 1μL 上样缓冲液，混匀。
点入预先制备好的 1%的琼脂糖凝胶中电泳 1 hr在紫外灯下检测扩增结果三）扩增片段的回收（三）扩增片段的回收根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段1）称量一 2 mL.的 Eppendorf 管质量，记录2）在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入 2 mL 的 Eppendorf 管内，称量计算凝胶质量3）每 100 mg 凝胶加入 100 μL Binding Buffer，混匀60℃温育至凝胶融化4）全部转入 UNIQ-10 柱中10000 rpm 离心 1 分钟，倒去收集管内的液体5）加入 500 μL Binding Buffer，10000 rpm 离心 1 分钟，倒去收集管内的液体6）加入 70％乙醇（Wash Solution） ，10000 rpm 离心 0.5 分钟7）再 10000 rpm 离心 2 分钟彻底甩干乙醇吸附柱转移到一个新的 1.5ml 的离心管8）加入 30 μL 预热的洗脱缓冲液，室温放置 3 分钟12000 rpm 离心 2 分钟，流下的液体即为回收的 DNA 片段四）（四）DNA 片段测序片段测序将回收的片段送至生物公司测序，测序引物为 16S PCR 引物。
四、实验结果及分析四、实验结果及分析1．根据测序结果，到 NCBI 上进行比对，确定该未知菌的种属2．根据比对结果进行进化树的绘制写明所用软件及大致的分析方法3．分析讨论实验的过程及结果。