《体外低氧环境对人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化影响的初步研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《体外低氧环境对人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化影响的初步研究（95页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、华中科技大学博士学位论文体外低氧环境对人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化影响的初步 研究姓名：王庆德申请学位级别：博士专业：骨外科指导教师：杨述华20080419华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 1英文缩略词表英文缩略词表 缩写词缩写词 英文全称英文全称 中文名称中文名称 ATP adenosine tri-phosphate 三磷酸腺苷 bFGF basic fibroblastic growth factor 碱性成纤维细胞生长因子 BSP bonesialoprotein 骨涎蛋白 DEPC dielthyl pyrocarbona
2、t 焦炭酸二乙酯 ECM extracellular matrix 细胞外基质 EDTA ethylenediaminetetra-aceticacid 乙二胺四乙酸 FBS fetal bovine serum 胎牛血清 HIF-1 hypoxia inducible factor 1 低氧诱导因子-1 hMSCs human mesenchymal stem cells 人间充质干细胞 HSC hematopoietic stem cell 造血干细胞 MMP metallo matrix proteinase 金属基质蛋白水解酶 mRNA messenger ribonucleic ac
3、id 信使 RNA MSCs mesenchymal stem cells 间充质干细胞 OC osteocalcin 骨钙素 PBS phosphate buffer saline 磷酸盐缓冲液 pVHL protein von Hippel Lindau SDF-1 stromal cell-derived factor 1 基质衍生因子-1 VEGF vascular endothelial growth factor 血管内皮细胞生长因子 -actin beta-actin -肌球蛋白 独创性声明独创性声明 本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结
4、。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授
5、权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名： 指导教师签名： 日期： 日期： 年 月 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 2体外低氧环境对人骨髓间充质干细胞成骨 诱导分化影响的初步研究 摘摘 要要 第一部分第一部分 人骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定人骨髓间充质干细胞的体外培养及鉴定 目的目的 体外分离培养人骨髓间充质干细胞（hMSCs）并进行鉴定，为组织工程提供适宜的种子细胞。 方法方法 抽取健康成人骨髓，采用人淋巴细胞分离液分离纯化获取 hMSCs，观察细胞形态特征、生长状况，从表面抗原表达及成骨分化
6、能力两个方面进行鉴定。 结果结果 分离细胞贴壁生长，呈集落样增殖，放射状、涡漩状分布排列。免疫细胞化学检测细胞表达CD44和CD71，CD34、CD45 呈阴性表达，细胞表面标志表达与间充质干细胞的特征一致。分离的细胞经过成骨条件培养基诱导分化后2 周，细胞碱性磷酸酶染色阳性，4周后可以形成钙结节，证明所培养细胞有向成骨细胞分化的潜能。表明分离细胞为间充质干细胞。 结论结论 采用人淋巴细胞分离液分离细胞，能获得较为纯化的 hMSCs，可为培养 hMSCs提供稳定的分离方法。 关键词关键词 间充质干细胞 细胞培养 碱性磷酸酶 第二部分第二部分 低氧环境对人骨髓间充质干细胞生物学行为的影响低氧环境
7、对人骨髓间充质干细胞生物学行为的影响 目的目的 建立人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells ,hMSCs）体外低氧培养及向成骨细胞分化的生物模型，研究其生物学特征，为骨组织工程提供实验依据。 方法方法 采用人淋巴细胞分离液分离健康成人骨髓中的间充质干细胞。取第 3 代细胞，根据培养氧浓度及培养基类型分为 4 组：正常氧组（20O2加 DMEM-LG） 、低氧组（1O2加 DMEM-LG） 、正常氧成骨诱导组（20O2加条件培养基）及低氧成骨诱华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3导组（1O2加条件培
8、养基） ，通过细胞计数、细胞增殖测定（MTT 法） 、增殖细胞核抗原 （PCNA） 检测、凋亡蛋白及集落形成检测， 观察低氧对 hMSCs 增殖凋亡的影响；RT-PCR 检测、ALP 活性检测及茜素红染色，研究低氧环境对 hMSCs 成骨分化的影响；检测 Fibronectin、Laminin 和 Collagen蛋白表达，观察低氧对 hMSCs 细胞外基质分泌的影响。 结果结果 与正常氧组相比， 低氧组中的hMSCs有较高的增殖速度， 生长差异显著(P0.05) Conclusion hMSCs maintained the ability to thrive in prolonged hy
9、poxic conditions suggesting that hypoxia may be an essential element of the in vivo hMSCs niche.chronic 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 7hypoxia is a key parameter that infuences the in vitro biological behavior of hMSCs. Keys words mesenchymal stem cells;hypoxia;osteoblast;cell cultu
10、re Part Three Effects of chronic hypoxia on the expression of HIF-1、SDF-1 and VEGF165 in human bone marrow mesenchymal stem cells Objective To establish a model of chronic hypoxia in vitro culture , and observe the epression of HIF-1、 SDF-1 and VEGF165 in cultured adult human bone marrow stromal cel
11、ls(hMSCs) ,That will be experimental basis of MSCs used as the functional cells for hypoxic disease therapy;by comparision of expression of hypoxia-inducible factor-1(HIF-1)、stomal cell- derived factor (SDF-1) and Vascular Endothelial Growth Factor 165(VEGF165 ) proteins,to document mechanism of hMS
12、Cs osteo-differentiation. Methods Bone marrow was obtained by aspirated in the posterior superior iliac spine from three adult patients whose marrow is normal. Cells were isolated by gradient centrifugation and grown to confluence.The second passages According to the oxygen concentrations and nutrie
13、nt mediums, was categorized into four groups: normoxic group （ 20 O2, DMEM-LG）, hypoxic group（1O2, DMEM-LG）, normoxic osteoblast induction group（20O2 , conditioned medium） , hypoxic osteoblast induction group （1O2, conditioned medium）.HIF-1、SDF-1 and VEGF proteins were measured by immuocytochemistry
14、,Western-blot was used to detect HIF-1and SDF-1 protein. HIF-1、SDF-1 and VEGF165 mRNA were detected by real-time RT-PCR. Results cytoplasm of hMSCs of n group and nos group were stained by HIF-1positive,and strong positive staining were found in cytoplasm and cell nuclei of hMSCs in h group and hos
15、group. Under chronic hypoxic condition,hMSC expressed mRNA of HIF-1、SDF-1 and VEGF165 more strongly than that under normal oxygen condition(P0.05),expression of HIF-1mRNA in n group and nos group were in low level(P0.05） ；n组和 nos 组有少量的 HIF-1 蛋白表达（P0.05)；比较各组HPP-CFU可见E、F、G、H三维培养显著多于A、B、C、D二维培养(P0.05)。造血干祖细胞培养5w后二维培养体系中饲养细胞层已逐渐凋亡，崩解，脱落，绝大部分的二维培养体系均破坏；而三维培养体系中饲养细胞层
