《小鼠ACE2基因真核表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《小鼠ACE2基因真核表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖的影响（58页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、福建医科大学硕士学位论文小鼠ACE2基因真核表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖 的影响姓名：卢卓强申请学位级别：硕士专业：内科学（心血管）指导教师：晋学庆20090401小鼠A C E 2 基因真核表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖的影响小鼠A C E 2 基因真核表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖的影响中文摘要目的本研究拟构建小鼠A C E 2 基因的真核表达载体，并观察A C E 2 基因转染大鼠血管平滑肌细胞( V S M C ) 后对A n g I I 促V S M C 异常增殖效应的影响，初步探讨产生该影响的可能机制。方法1 通过R T - P C R 从小鼠肾脏扩增出小
2、鼠A C E 2 基因全长c D N A ，并通过酶切连接、转化等分子生物学方法将其连接到载体p c D N A 3 1 H y g r o ( + ) 上，从而构建小鼠A C E 2 基因的真核表达载体p m A C E 2 ，并通过酶切和测序鉴定。2 通过脂质体法将所构建的p m A C E 2 转染C O S 7 细胞，4 8 小时后收集蛋白，经过W e s t e r n B l o t 来验证该p m A C E 2 的表达功能。3 用脂质体法将p m A C E 2 转染原代培养的大鼠胸主动脉V S M C 后给予A n g I I ( 终浓度1 0 。7 m o l L ) 处理
3、，同时设正常细胞组、A n gI I 组和空载体p c D N A 3 1 H y g r o ( + ) 转染+ A n gI I 组作为对照，通过C C K 8 和检测各组细胞周期两项指标来观察A C E 2 基因转染对A _ n gI I 促V S M C增殖效应的影响，初步探讨A C E 2 发挥上述作用的机制。结果1 通过测序证实成功克隆小鼠A C E 2 基因全长e D N A 并将其连接至载体p c D N A 3 1 H y g r o ( + ) 上，测序结果提示存在3 处同义突变；2 所构建的p m A C E 2在真核细胞中具有表达功能；3 A n g I I 组O D
4、值较正常细胞组明显增高( 氏O 0 5 ) ，p m A C E 2 + A n gI I 组与A n gI I 组相比O D 值显著降低( 尸 T 、1 2 7 8 位C - T 、1 6 0 5 位T - C 。( 图4 )f 丛坩涮。j ；：。j 蝗呶j 嫩燃燃漱撼蹴湘“I 洲蝴翩挑洳嘲溅w 翩4 枷掀m 6 越：溅蝴黜峨漱黼燃巍燃j i滞一一一妣如娩一“ m 涩小鼠A C E 2 基因真核表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖的影响m t T 0 ：一m 嚣：优裂：c 豫一m 恶c t T ：特小品k 朵日小： t 矗器眦础艘进漱勰麒她J 0 I 蜘撼恻_ | 0 c ( I 姗执 “
5、d 缘；蛊w 。器”T “T 蜜n 冼，m t 带。器c ，r 揽K # ：c 0 ：I 始蚍燃黼t 臻拟州棚蚶花 阮州搬I - c * l c 器，c ：职! c ：c ：；k cT 摆T 挫hc 小0 锶巾是k 小T 。2 ： T 揲? * ，( l ：嚣伯擞川础m m 攫：- T c 小? 艘T E 般j 州t ：c 。是诫二i 0 ：! 。二哉k ：。：而；堤元：勰i = ：再磊_ j 甄。磊 辱忑越“y 、n蕊腑、i均小鼠A C E 2 基因真槛表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖的髟响。 ：器：嚣；。船卅。琵L m 讪靠k m ：兰“。 * 器 。：2 ； ：一：t ，一t ：w
6、 一；j m I - 一：* 一，t ；： “0 器：口f k t 盘- - T o k M 0 一c ：器t n ! 芒 翟“一 T 九4l ，。Ion4一 6 44 澄坯翩：l l 胝测谢地潋；c 9 趔燃嬲I 珧舭4lI 勘嘲搬I 铡锄加溅蝴徘嫩j 妇嫩 ； 州f ：。船小巾。：t 0 。“嚣：c ，o i ，t 蛊! 0 t t a m ：t 嚣：n ”T 等m T 芷：蠢： 拙Iim被jjm似槲咖i舢m础iij小鼠A C E 2 基园真核表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖的影响瑚f c I 必蚴捌删进删叫删_ ) ! l 刑L J粼I删 j 褂。图4A T - P C R 产物溪
7、0 序波形图。4 提取质粒p c D N A 3 1 H y g r o ( + ) 与原质粒电泳比较 M126 0 0 0 b p5 0 0 0 b p一一5 5 9 7 b pM ：M a k e r D L ：1 0 0 0 0 tl ：扩增后提取的p c D N A 3 1 m y g r 0 ( + ) ：2 原质粒p c D N A 3 I H y g r o ( + )囤5 扩增的p c D N A 3 1 m y F “+ ) 与原质粒的电泳结果从电泳结果可见经转化细菌D H 5 c t 扩增质粒抽提后得到的质粒与琢质粒完全相同( 图5 ) 。小鼠A C E 2 基因真核袭选载
8、体的构建及其对血管平滑肌细胞堪殖的影响5R T P C R 产物、p e D N A 3 1 H y g r o ( + ) 、Ml7 0 0 0 b p3 0 0 0 b p2 0 0 0 b p重组质粒p r o - A C E 2 酶切后电泳比较234 r 一M ：M a l k g rD L 7 0 C ( ：1 ：R T - P C R 产物；2 l 空载体p c D N A 3 I H y g r o ( + ) ：3 ：经H i n d m 单酶切的重组质粒p r o - A C E 2 4 ：经H i n d l T I 与B a m HI 双酶切的重组质粒p r o - A
9、C E 2圈6R T - P C R 产物、P C D N A 3 1 H y g r o ( + ) 、重组质粒p m A C E 2 酶切电泳图经过将R T - P C R 产物、P C D N A 3 1 H y g r o ( + ) 、重组质粒p m - A C E 2 单双酶切产物电泳比较，可以明确已经将目的基因A C E 2 成功连接至载体p c D N A 3l - h y g r o ( + ) 上( 图6 ) 。6 W e s t e r n - B l o t 结果1231 2 0 K nI ：正常细胞组；2 ：空载体转染组3 ：p r o - A C E 2 转染组图7
10、p m - A C E 2 转染C O S 7 细胞后的蛋白表达功能经过特异性较高的W e s t e r n - B l o t 检测出p r o - A C E 2 转染C O S 7 细胞后表达了大小为1 2 0 K D 左右的条带( 圈7 ) ，和文献报道的A C E 2 分子量大小相近，而作为对照的正常细胞组和空载体p c D N A 3 ，I H y g r o ( + ) 转染组则在相应位置未见明显条带提示了p m - A C E 2 具有在真核细胞中表达A C E 2 蛋白的功能。小鼠A C E 2 基因真核表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖的影响讨论R A S 是哺乳动物
11、心血管、肾脏功能的主要调节器，其在维持机体血压稳定和水电解质平衡中发挥了中枢性作用。传统的观点认为：R A S 主要是由肾素、血管紧张素原( A n g ) 、血管紧张素I ( A n gI ) 、血管紧张素I I 以及血管紧张素转化酶( A C E ) 组成，肾素具有蛋白酶活性，能将肝脏产生的A n g 转化为1 0 肽的A n gI ，A n gI 则在A C E 的作用下去掉2 个氨基酸产生8 肽的A n gI I ，后者与血管紧张素A T l 受体结合，可收缩血管、刺激纤维细胞增生和心肌细胞肥大，导致心脏肥厚等一系列心血管损害作用。R A S 的过度激活与心血管病以及由这些疾病所致的脏
12、器损害( 如：心脏、血管、肾脏等) 存在相关性【7 】，因而调控R A S活性是临床治疗心血管疾病的主要方法之一【8 J ，A C E 及A n gI I 受体特异性阻断剂已经成为高血压和心力衰竭治疗的首选药物。近年来，在经典的药理学研究技术、现代基因组学和蛋白质化学方法的联合运用下，发现了R A S 的许多新成员：A n g l V 的结合部位、胰岛素调节氨基肽酶、A C E 2 、肾素受体、A n g 一( 1 7 ) 、A n g - ( 1 - 7 )受体M a s 、A n g ( 3 - 8 ) 、A n g ( 2 7 ) 。其中A C E 2 的出现改变了人们对R A S 的传
13、统认识。A C E 2 、A n g - ( 1 7 ) 和M a s 受体构成了R A S 的一个新分支：A C E 2 一A n g 一( 1 - 7 ) M a s 轴，该分支能对抗A n g I I 的作用、调节心血管和肾脏功能，并能降低血压和保护心血管。A C E 2 是D o n o g h u e 和T i p n i s 分别从人类心衰左心室e D N A 文库和人淋巴瘤c D N A 文库中克隆出一种新的A C E 同系物，对A C E 2 和基因序列分析显示，该基因含有1 8 个外显子，定位于X 染色体上。A C E 2 可以水解A n g I I 生成A n g 一( 1
14、 7 ) ，这是A C E 2 最重要的功能，A C E 2 也可以通过水解A n gI 羧基末端的亮氨酸残基将其转化为A n g 一( 1 - 9 ) ，并进一步在A C E N E P 的作用下生成A n g 一( 1 - 7 ) ，但经该途径生成A n g 一( 1 - 7 ) 的效率仅仅为前一途径的1 4 0 0 【9 1 。A n g - ( 1 - 7 ) 已证明为心血管功能的重要调节因子，它可以促进血管舒张，凋亡以及生长抑制【1 0 , 1 1 , 1 2 】。体外实验证实A C E 2 还可以作用于d e s A r g 9 缓激肽、神经加压素1 1 3 、水解酶a p e l
15、 i n 1 3和强啡肽A 1 1 3 的C 末端残基。A C E 2 对a p e l i n 1 3 和a p e l i n 3 6 有较高的催化效率【9 】，而a p e l i n 1 3 已经被证明能使内皮剥离的冠状动脉血管收缩，给予a p e l i n 1 3会导致小鼠高血压；d e s A r g 9 ，缓激肽，强啡肽A 1 1 3 等A C E 2 作用的底物能激活G 蛋白偶联受体和阿片受体，对心肌细胞的收缩起负性作用，同时可以调节小鼠A C E 2 基因真核表达载体的构建及其对血管平滑肌细胞增殖的影响痛觉。因此，A C E 2 不仅可以在R A S 发挥作用，在神经传递中可能也有作用【1 3 】。A C E R 是果蝇体内A C E 2 的同系酶。研究证实A C E R 缺失果蝇的心脏原始细胞数目减少，中胚层发育异常，同时心脏管腔发育有致死性结构缺陷【1 4 】，这一实验结果提示A C E 2 可能在心脏的形态发育、细胞分化中发挥重要作用。当前关于A C E 2 的许多研究证据表明A C E
