Inoue 法制备感受态大肠杆菌总结法制备感受态大肠杆菌总结1．． 培养基的准备培养基的准备SOB 培养基：培养基： 100ml胰化蛋白胨 2 g酵母提取物 0.5 g NaCl 0.05 g250mM KCl 1 ml高压灭菌 使用前加 2mol/L MgCl2 0.5 mlSOB 琼脂板琼脂板（含 20mmol/L MgSO4 和 20mmol/L 氨苄） 100ml胰化蛋白胨 2 g酵母提取物 0.5 g NaCl 0.05 g琼脂 1.5 g250mM KCl 1 ml高压灭菌 50℃温浴再加 2mol/L MgSO4 1 ml2mol/L MgCl2 0.5 ml20mg/ml 氨苄 100 ul混均倒平板（90mm2）SOC 培养液培养液 50ml胰化蛋白胨 1 g酵母提取物 0.25 g NaCl 0.025 g250mM KCl 0.5 ml2mol/L MgCl2 0.25 ml1mol/L 葡萄糖(0.22um 过滤除菌) 1 ml2． INOUE 转化缓冲液的准备：转化缓冲液的准备：(250ml)MnCL2.4H2O 2.72g CaCL2.2H2O 0.55g 定容到 250mlKCL 4.6625gPIPES(0.5mol/L,PH6.7) 5 ml0.45μm 孔径滤膜过滤，分 50ml 每份—20℃保存3．． 挑取一个经 37℃培养 19h 平皿上的单菌落（2~3mm 直径） ，接种至 250ml 锥形瓶中的25ml SOB 培养液中，37℃摇床（250~300r/min）培养 6~8 小时。
（此时培养物（此时培养物 ODOD600600约约0 0680680））4．． 从上述的 25ml 的初始培养物接 4ml 大肠杆菌于盛有 100ml SOB 的 500 ml 锥形瓶中，于 18~22℃中速摇床过夜次日次日取出达到 OD 值 0.55 时的培养液置于冰浴中 10min5． 平均分装到两个 50ml 的贝克曼离心管于 4℃以 2500g 在贝克曼离心机上离心 10min 收集菌体6． 倒去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上 2min 以吸干剩余液体，用真空吸引器将贴附在管壁的培养基吸干7． 加 32ml 冰预冷的 Inoue 转化缓冲液轻轻旋转重悬细菌(没有用枪吹吸和振荡重悬没有用枪吹吸和振荡重悬)8． 于 4℃ 2500g 离心 10min 收集菌体10．倒去上层培养液，将离心管倒扣在吸水纸上 2min 以吸干剩余液体，用一真空吸引器将附在管壁上的培养基吸干冻存感受态细胞冻存感受态细胞11．用 8ml 预冷的 Inoue 转化缓冲液轻轻重悬沉淀(此时两管混合于一管此时两管混合于一管)12．向剩余的细胞中加 0.6mlDMSODMSO，混匀冰浴 10min.13．迅速将悬液分装到冷却的无菌 1.5ml 离心管中（每管每管 200ul200ul） ，没入液氮中快速冰冻感受态细胞。
贮存于-70℃备用转化转化15．要转化的 PET 加入装有感受态细胞（加 DMSO 保存于-70℃的感受态细胞）的管中，轻轻旋转几次混匀内容物设一对照管：只有感受态细胞冰浴 30min [保存于保存于-70℃-70℃的感受的感受态细胞从冰箱拿出后用手心溶解后立即在冰浴上冰浴态细胞从冰箱拿出后用手心溶解后立即在冰浴上冰浴 10min,10min,然后再加然后再加 INSERTINSERT DNA.DNA.]16．将管放入预加温到 42℃的水浴中，恰恰放置恰恰放置 90s90s，不要摇动不要摇动17．快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却 1~2min18．每管加 800μl 在 37℃培养箱中温浴到 37℃的 SOC 培养基，然后将管转移到 37℃摇床上，温育 45min（中速温和摇培中速温和摇培） ，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗标记基因19．将 200μl 体积的已转化的感受态细胞转移到含抗生素和 20mmol/L,MgSO4SOB 培养基上于 37℃培养箱正放到液体被吸收20．倒置平皿 12~16h 后可出现菌落转化 PET 标准质粒的结果如下图:图 A 转化 10μl 浓度为 50ng/μl 的 PET 标准质粒图 B 转化 2μl 浓度为 50ng/μl 的 PET 标准质粒图 C 空白对照分析：（仅与本人每次成功的经验为准，供参考）分析：（仅与本人每次成功的经验为准，供参考）1、本实验所用的菌株是 XL1—BLEU ，注意不同种的大肠杆菌的各种参数不同。
2、培养基需新鲜配置，液体培养基的瓶子要专用，每次使用后洗净凉干后，锡铂纸封口，使用前只用清水洗后蒸馏水荡几遍，最后用超纯水润洗两遍注意专用器皿都不用任何清洁剂，第一次使用时可以用稀的洗液浸泡3、培养初始培养物的培养基可以用 SOB 或 LB，其它步骤中所用各培养基均用SOB（MgCl2需在使前加） 4、大体积培养菌时如温度固定在 18~22℃，有如下细菌 OD600的增长经验数值,多次记录时发现增长的情况相近，以一次记录为例希望能为以后制作时带来一点方便：时间 OD6006：40 0.1007：40 0.134 8：40 0.165 9：40 0.19510：20 0.21811：24 0.25812：19 0.30313：00 0.32713：50 0.38614：50 0.43315：45 0.48316：18 0.52016：40 0.545 16：50 0.5535、实验中有两次重悬沉淀步骤中要注意，勿用枪头吹吸的方法，只需在加入缓冲液以后轻轻悬转离心管就行了（轻重的标准是重悬时不会使里面的液滴飞溅） 。
6、感受态细胞有液氮速冻后于-70℃可以长期保存（半年内感受性不会下降，以后将再继续延长观察期） 7、转化实验中最关键的是热激一步，温度，时间绝对准确性还需要注意的是在热激过程中离心管不能摇动，包括在取出离心管时都不能摇动，取出后立即放入冰浴中静置 2min。