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1、实验二、聚合酶链式反应(实验二、聚合酶链式反应(PCR)实验内容:实验内容:采用 PCR 法进行基因扩增目的要求:目的要求:掌握 PCR 反应的原理和方法 实验原理实验原理:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法,为最常用的分子生物学技术之一。典型的 PCR 由(1)高温变性模板;(2)引物与模板退火;(3)引物沿模板延伸三步反应组成一个循环,通过多次循环反应,使目的 DNA 得以迅速扩增。其主要步骤是:将待扩增的模板 DNA 置高温下(通常为 93-94)使其变性解成单链;人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温
2、度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合,两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短;耐热的 DNA聚合酶(Taq 酶)在 72将单核苷酸从引物的 3端开始掺入,以目的基因为模板从 53方向延伸,合成 DNA 的新互补链。试剂准备:试剂准备:1. DNA 模版2对应目的基因的特异引物310PCR Buffer 42mM dNTPmix:含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM5Taq 酶操作步骤:操作步骤: 1在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌 0.5ml 离心管中。10PCR buffer 2.5 lMg2+ 2 l dNTP mix (2mM) 0.5 l引物 1(1
3、0M) 1 l引物 2(10M) 1 lTaq 酶 (2U/l) 0.25 lDNA 模板(50ng-1g/l) 1 lddH2O 16.75 l 总体积 25 l视 PCR 仪有无热盖,不加或添加石蜡油。2 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置 PCR 仪上,执行扩增。 一般程序:93预变性 3min,93变性 30s 58退火(温度视引物 Tm 值而定) 30s 30-35 循环72延伸 90s,72 保温 10min。3 结束反应,PCR 产物放置于 4待电泳检测或-20长期保存。 4PCR 的电泳检测:配制 1%的琼脂糖凝胶,胶体凝固后取 5-10l PCR 产物 进行电泳检测。思考题:思考题:(1) PCR 反应产物经电泳检测,出现非特异性条带的可能原因? (2) 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的原理?