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1、实验二、聚合酶链式反应（实验二、聚合酶链式反应（PCR）实验内容：实验内容：采用 PCR 法进行基因扩增目的要求：目的要求：掌握 PCR 反应的原理和方法 实验原理实验原理：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。典型的 PCR 由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的 DNA 得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板 DNA 置高温下（通常为 93-94）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温
2、度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的 DNA聚合酶（Taq 酶）在 72将单核苷酸从引物的 3端开始掺入，以目的基因为模板从 53方向延伸，合成 DNA 的新互补链。试剂准备：试剂准备：1. DNA 模版2对应目的基因的特异引物310PCR Buffer 42mM dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM5Taq 酶操作步骤：操作步骤： 1在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌 0.5ml 离心管中。10PCR buffer 2.5 lMg2+ 2 l dNTP mix （2mM） 0.5 l引物 1（1
3、0M） 1 l引物 2（10M） 1 lTaq 酶 （2U/l） 0.25 lDNA 模板（50ng-1g/l） 1 lddH2O 16.75 l 总体积 25 l视 PCR 仪有无热盖，不加或添加石蜡油。2 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置 PCR 仪上，执行扩增。 一般程序：93预变性 3min，93变性 30s 58退火(温度视引物 Tm 值而定) 30s 30-35 循环72延伸 90s，72 保温 10min。3 结束反应，PCR 产物放置于 4待电泳检测或-20长期保存。 4PCR 的电泳检测：配制 1%的琼脂糖凝胶，胶体凝固后取 5-10l PCR 产物 进行电泳检测。思考题：思考题：(1) PCR 反应产物经电泳检测，出现非特异性条带的可能原因？ (2) 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的原理？
