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1、（丁香园（丁香园 protocol 2008）一、常规的试剂配制：一、常规的试剂配制：1、培养基：选用高糖型 DMEM/F12 (1:1)培养基干粉（含 15 mmol Hepes），每升培养液 中加入碳酸氢钠 1.8 g，调节 pH 值 7.0，0.22 m 的微孔滤膜过滤除菌后，加入谷氨酰胺、 无菌的青霉素和链霉素液，使其终浓度分别为 0.5 mmol/L 、100 U/ml 和 100 g /ml，分装后置于 4保存，临用前加入 2%的 B27。神经细胞代谢旺盛，选用高糖型培养基；谷胱甘肽可保持培养基还原状态，营养成分稳定；B27 是公认的刺激神经元生长的营养因子， 不过价格挺贵；PH
2、值很关键，Hepes 是优秀的缓冲系统，pH 值调好后能保持很长时间；2、多聚赖氨酸溶液的配制： 称取 1.5 mg L-多聚赖氨酸溶于 100 ml PBS，0.22 m 的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于 4 保存，可长期使用；3、磷酸盐缓冲液（PBS）的配制： 称取 8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO412H2O 和 0.2 g KH2PO4 充分溶于 900 ml dd H2O，调节 pH 值为 7.2，补 dd H2O 至 1000 ml 并分装，高压灭菌（121126 ），4 备用；4、D-Hanks 液的配制：称取 KCl 0.4 g，KH2PO4
3、0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO412H2O 0.08 g，溶于 dd H2O 中，调节 PH 值为 7.2，定容至 1000 ml，高压蒸汽灭菌（121126 ），4备用；5、0.25%胰蛋白酶的配制：称取 0.25 g 胰蛋白酶粉末，少许 D-Hanks 溶液调成糊状，用 D-Hanks 定容至 100 ml，混匀，冰箱内放置过夜，滤纸过滤后，0.22 m 微孔滤膜过滤，分装，-20 保存。二、试验操作过程：二、试验操作过程：1、包被：培养前晚上将培养瓶（板）用多聚赖氨酸包被 10 min，吸除，无菌操作台上 15min 自然晾干，置于培养箱中备
4、用；2、取脑：选取新生 24 h 的 SD 大鼠数只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无 菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，D-hanks 液洗数次； （预先准备至少 4 把眼科剪刀，分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第 3 步的剪组织这 4 个 操作）3、分离：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海 马组织，置于冰浴的 D-hanks 液中，仔细剔除微血管，用充分剪碎组织；4、消化：加入同体积 0.125%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，37 培养箱内消化 20 min 左右，期间轻摇数次；过滤：加入数滴胎牛血清终止消化，用尖头吸管
5、轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即 停止吹打，动作要轻柔，用 150 目网筛过滤，收集细胞悬液；5、接种：以 1100 rpm 离心 5 min，倾去上清，用 DMEM/F12 培养液重悬细胞，轻轻吹打， 台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为 1 00000 个/ml，加入终浓度为10%胎牛血清后接种于培养瓶（板）中，置于 37 、含 5% CO2 培养箱中培养；12 小时内禁止晃动6、换液：接种后 24 h 将培养液全量换成无血清 DMEM/F12 培养液，第 48 h 时加入终浓 度为 10 mol/L 的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长，随后每 3 d 半量换液。此外，原代培养的海马组织由多种细胞构成，如成纤维细胞、胶质细胞等，成分复杂，因 此原代培养过程中细胞纯化是关键的一步。本人主要采取以下措施来达到细胞纯化：（1）海马组织取材时组织定位准确，由于海马游离于大脑皮层，这一点容易做到；（2）消化前，细心剔除微血管；（3）过滤时选择 150-200 目筛网，尽量使培养的细胞呈单个或数个成团；（4）接种 24 h 时需全量换培养基，除去未贴壁的死细胞；（5）接种 48 h 时加一定浓度的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞（胶质细胞和少许成纤维 细胞）的过度生长。细胞生长 7 天的情况：
